文档介绍：2017-1-20 2017-1-20 1 1一、聚合酶链式反应( 一、聚合酶链式反应( PCR PCR ) ) ??聚合酶链式反应( 聚合酶链式反应( polymerase chain reaction, polymerase chain reaction, PCR PCR ):是一种体外酶促扩增特定):是一种体外酶促扩增特定 DNA DNA 片段的技片段的技术,即将微量的术,即将微量的 DNA DNA 进行成倍扩增。进行成倍扩增。 2017-1-20 2017-1-20 2 2 (一)原理(一)原理: : 建立在建立在 DNA DNA 复制原理基础上的一种技术。复制原理基础上的一种技术。 2017-1-20 2017-1-20 3 3 2017-1-20 2017-1-20 4 4 (二)典型的(二)典型的 PCR PCR 包括许多循环,每个循环包括三个步骤: 包括许多循环,每个循环包括三个步骤: ( (1 1) )高温高温变性模板使之成为单链, 变性模板使之成为单链, 95 95 度约度约 1min 1min ; ; ( (2 2) )低温低温使引物与单链模板退火(复性) 使引物与单链模板退火(复性) 55 55 度左右; 度左右; ( (3 3) )中温中温使引物沿模板延伸, 使引物沿模板延伸, 75 75 度左右。度左右。经经n n次( 次( 25-30 25-30 次)循环后,反应混合物中所含目的次)循环后,反应混合物中所含目的 DNA DNA 片段片段(双链)的拷贝数理论上最高值为(双链)的拷贝数理论上最高值为 2 2 n n。但是,在。但是,在第三轮第三轮循环循环后,才会出现目的后,才会出现目的 DNA DNA 片段。片段。 2017-1-20 2017-1-20 5 5 2017-1-20 2017-1-20 6 6思思考考题题??扩增片断的长度的是如何决定的? 扩增片断的长度的是如何决定的? ??若以若以 N N 表示扩增循环数,当一条双链模板表示扩增循环数,当一条双链模板循环扩增循环扩增 30 30 次时,反应体系中总分子数多次时,反应体系中总分子数多少?非目的产物多少?目的产物多少? 少?非目的产物多少?目的产物多少? ??若用一条引物能否实现大量扩增? 若用一条引物能否实现大量扩增? 2017-1-20 2017-1-20 7 7 (三) (三) PCR PCR 反应体系: 反应体系: 反应缓冲液反应缓冲液( ( 10 10 × × PCR Buffer PCR Buffer ) ) 脱氧核苷三磷酸底物脱氧核苷三磷酸底物( ( dNTP dNTP mix mix ) ) 耐热耐热 DNA DNA 聚合酶聚合酶( ( Taq Taq 酶,可耐受酶,可耐受 95 95 度左右高温) 度左右高温) 寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物( ( Primer1 Primer1 , , Primer2 Primer2 ,约,约 20 20 个核苷酸, 个核苷酸, 与目的与目的 DNA DNA 两侧的区域互补) 两侧的区域互补) 靶序列靶序列( ( DNA DNA 模板)五部分组成。模板)五部分组成。 2017-1-20 2017-1-20 8 8 2017-1-20 2017-1-20 9 9 1. 1. 耐热耐热 DNA DNA 聚合酶聚合酶 Taq DNA 聚合酶的特点 Taq DNA 聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌 YT-1 中分离纯化而得。 1) 具有 5’-3’聚合酶活性和 5’-3’核酸外切酶活性 2) 最适反应温度为 80 ℃ 3) 最适 和最佳反缓冲液 Tris · HCl 4) 最佳二价阳离子 Mg 2+,其浓度取决于 dNTP 浓度( 2 mM ) 5) 具良好的热稳定性:在 90 ℃下连续反应 30 分钟仍有约 50% 的酶活核苷酸错误掺入的几率比较高 2017-1-20 2017-1-20 10 10 Taq DNA 聚合酶的特性