文档介绍：学****PCR扩增技术
PCR扩增技术
DNA聚合酶
引物
引物
M13噬菌体
Sanger的测序技术
引物
DNA聚合酶
引物
引物
Mul学****PCR扩增技术
PCR扩增技术
DNA聚合酶
引物
引物
M13噬菌体
Sanger的测序技术
引物
DNA聚合酶
引物
引物
Mullis的构思
DNA聚合酶
DNA聚合酶
特定DN***段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
酶活性(%)
温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
100
80
60
40
20
72℃
94℃
55℃
PCR循环
一、PCR的基本原理
PCR技术实际上是DNA的体外扩增技术。
其原理类似于DNA在体内的复制过程。
只要提供一个合适的条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNA的体外合成。
PCR反应是一个重复进行的DNA复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、DNA聚合酶催化新链DNA的合成。
这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以复制。
1、变性
通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。
2、退火
将温度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5℃，通常为55～65℃），引物与DNA模板互补结合，形成杂交链。
3、延伸
在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，于70～74℃以引物3′端为起始点按5′→3′方向使DNA新链延伸。
上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过25－30个循环，可使新生的DN***段得以扩增106－9倍（至少扩增105 倍）。
PCR的反应原理也就是PCR的基本过程。
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程
PCR的特点
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1~3步
25~30轮
目的DN***段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
复性（退火）
延伸
变性
复性（退火）
延伸
变性
复性（退火）
延伸
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
PCR反应条件
（2）引物浓度
- mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
- U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数
变性
使双链DNA解链为单链
95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC，
延伸时间由扩增片段长度