文档介绍：血清 ALT 活性的测定生物化学与分子生物学教研室【实验目的】 ALT 活性测定的基本原理。 ALT 的测定方法(赖氏法)及临床意义。【实验原理】丙氨酸氨基转移酶(ALT) ,又称谷丙转氨酶(GPT) ,在37℃、 的条件下,可催化基质(底物)液中的丙氨酸与α-***戊二酸生成谷氨酸和***酸: 生成的***酸可与起终止和显色作用的 2,4 二硝基苯肼发生加成反应, 生成***酸-2,4- 二硝基苯腙,进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围内与***酸的生成量,亦即与 ALT 活性的高低成正比关系。据此与同样处理的***酸标准液相比较,便可算出或通过标准曲线查出血清中 ALT 的活性。一是金氏法( King 法)、穆氏法( Mohun 法)和赖氏法( Reit man -Frankel 法)。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间: King 法 60min , Mohun 法和 Reiman 法 30min 。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。赖氏法没有制定自身的单位定义,而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。 ALT 活性测定主要有两类方法: ?二是卡门氏( Karman )法,其原理如下: 由于 NADH 在波长 340nm 处有特异吸收峰,因此 ALT 的活性可通过 NADH 的减少量,亦即通过 340nm 吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。 1个卡门氏单位的定义是:在温度 25℃, ,波长 340nm , 光径 1cm 的条件下, 1ml 血清使 NADH 的吸光度下降 的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度,而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。【方法评价】***酸+NADH+H +乳酸+NAD + LDH 【试剂】 磷酸盐缓冲液() :将 420mlNa 2HPO 4溶液和 2PO 4溶液混匀,置冰箱保存。 (DL- 丙氨酸 200mmol/L ,α—***戊二酸 2mmo1/L) :精确称取 DL- 丙氨酸 g和α—***戊二 ,溶于 磷酸盐缓冲液中,用 1mol/LNaOH 溶液(约 0. 5ml )调至 ,再加磷酸缓冲液至 100ml, 最后加入麝香草酚(每 L可加 )防腐, 置冰箱中保存,可用一个月。 —二硝基苯肼溶液(1mmol/L) :称取 —二硝基苯肼 , 溶100ml/L 盐酸中, 置室温保存。 氢氧化钠溶液: NaOH16g 溶于蒸馏水中调至 1000ml 。 5.***酸标准液(2mol/L) :***酸钠 ,置于 100ml 容量瓶中,加 硫酸至刻度。 6. 2HPO 4溶液:称取 Na 2HPO 4·2H 溶于少量蒸馏水中,待溶解后加蒸馏水至 1000ml ,至冰箱中保存。 7. 2PO 4溶液:称取 KH 2PO 溶于少量蒸馏水中,待溶解后加蒸馏水至 10 00ml ,至冰箱中保存。【器材】恒温水浴锅,723 型分光光度计,刻度吸量管,滴管,试管等。【试剂与器材】【步骤】加入物(ml) 管号 01234 磷酸盐缓冲液 2mmol/L ***酸标准液 基质溶液 相当于酶活力单位 0285797150 (2)分别向各管加入 2,4二硝基苯肼液 , 混匀后置 37℃水浴箱, 20分钟后取出, 分别向各管加入 溶液 。(3)混匀,放置 10分钟在 505nm 波长比色,以蒸馏水调零点,读取各管光密度。各管光密度值分别减去 0号光密度,以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准曲线。(4)当血清标本的酶活力单位超过 150 时,应将血清用生理盐水稀释 5倍或 10倍后再进行测定。(5)加入 2,4二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完全。(6)绘制标准曲线:第 1-4 管的光密度值值分别减去 0管光密度值值,所得差值为纵坐标;对应的卡门氏单位为横坐标,作图,画出标准曲线。(标准曲线已绘) : (1) 取5支试管,编号,按下表操作: 加入物( ml )测定管对照管血清 基质溶液 —混匀,置水浴箱中保温 30分钟 2