文档介绍：核酸检测培训
本讲稿第一页，共三十九页
主要内容
为什么要做核酸检测？
核酸是什么？
怎样进行核酸检测？
市场状况
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为什么要做性
DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态
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怎样进行核酸检测？
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核酸检测的一般流程
核酸样品的制备：
从血液、体液、组织中提取或PCR扩增
样品的检测：
核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等
结果判读：
电泳、膜、荧光定量PCR仪等
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核 酸 杂 交
核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。
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核酸提取
PCR扩增
探针点膜
交联
杂交
显色
结果判读
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PCR
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DN***段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA的复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
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PCR的产生
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实时荧光PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行分析的方法,可以进行定量和定性检测。
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荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。
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荧光定量PCR标记方法
内掺式染料
SYBR Green I
序列特异性探针
Taqman
Molecular Beacons
Dual Probes(FRET)
引物特异性探针
Amplifluor (Intergen)
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SYBR
GREEN
双探针
杂交
分子
信标
Taqman
引物特异
探针
性质
可逆荧光
积累荧光
熔点分析
能
不能
特异性
引物（非
特异性扩
增或引物
二聚体有
影响）
引物＋
2探针
引物
＋探针
引物
＋探针
引物（非特
异性扩增或
引物二聚体
有影响）
探针
无
有
有
有
无
通用性
通用
专用
专用
专用
专用
探针特点
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SYBR Green 融解曲线分析
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SYBR Green法优缺点
优点:
对DNA模板没有选择性
适用于任何DNA􀂉
使用方便--不必设计复杂探针􀂉
非常灵敏􀂉
便宜
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TaqMan探针法
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TaqMan法优缺点
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本讲稿第三十三页，共三十九页
市 场 状 况
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生产厂家
检测项目
使用技术
使用仪器
达安基因
HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒Ⅱ型、ɑ－地中海贫血、缺失型β-地中海贫血、淋球菌、血筛试剂
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