文档介绍：真菌操作常规20070307
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真菌鉴定操作常规
标本的采集和处理
1. 皮肤、指甲、毛发和组织
在收集标本前用75%酒精消毒病变部位。如果损害处已用了软膏、冷霜或粉剂应事先清洁。取材应用钝手术刀刮取表皮述两种温度下皆可生长，某些非致病隐球菌只在25℃或30℃生长，却不能在37℃生长。但初代培养在25℃生长而于37℃不长者，并不能排除该菌是新型隐球菌。隐球菌生长快慢不一，有的2-3天就开始长出小菌落，而有些则需2-3周才见生长。特别是经过抗真菌治疗的病人，标本虽直接镜检阳性，但培养可能为阴性。
3．玻片培养法（小培养）：
① 取无菌平皿倒入适量溶化的培养基（厚约1mm），凝固后以无菌刀片划成1cm2大小的
小块。取一小块移在无菌载片上，在小块四周接种待鉴定的菌株，盖上消毒的盖片。放
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入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，滤纸以无菌蒸馏水湿润（也可用无
菌湿棉球替代滤纸保湿）。将平皿置温箱培养。也可以在无菌载片上均匀地浇上溶化的
培养基，凝固后接种待鉴定菌株，盖无菌盖片，其余同上。
② 待菌落生长后，取出载片直接镜检。也可揭下盖片加95%酒精脱水，干后滴PVA乳酸
酚棉蓝液封固，镜检。
四、酵母样真菌的鉴定
酵母样真菌是以芽殖为主的单细胞真菌，菌落平滑、湿润，乳酪样或薄膜样，无毛样气生菌丝。其中主要致病菌见于念珠菌属、隐球菌属、球拟酵母属、酵母属和丝孢酵母属。按是否具有有性繁殖过程及有性孢子产生的方式、特点、形状和数目，酵母菌可归为3类：
(Ascomycotina)：可产生子囊孢子，如酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属；
(Basidiomycotina):可产生冬孢子或掷孢子，如冬孢酵母属、掷孢酵母属等；
(Derteromycotina)：尚未发现有性期，如念珠菌属、隐球菌属、红酵母属、
球拟酵母属、丝孢酵母属等。
（一）念珠菌属（Candida）的鉴定：
1. 涂片检查
革兰染色镜检可见圆形或卵圆形芽生孢子，一般为念珠菌。亦有从孢子的芽延长而成假菌丝者。有大量假菌丝存在说明念珠菌处
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于生长活跃状态。大小约3-7×3-14μm不等，单个、成堆或呈短链排列。孢子及菌丝皆为革兰阳性，呈紫色。但有时着色不均，有时少数呈革兰阴性。可报告“找到（圆形或卵圆形）真菌孢子（及假菌丝）”。
2．分离培养
沙氏平板或斜面以及中国蓝平板上有酵母样菌落长出后，采用以下方法鉴定：
① 形态学方法：
接种显色培养基（37℃培养）和玉米粉-吐温80培养基（25℃培养），根据菌落形态、显色特征和假菌丝特征鉴定菌种。其中，显色培养上生长绿色菌落为白色念珠菌，蓝色菌落为热带念珠菌，粉红干燥菌落为克柔念珠菌，紫色小菌落为光滑念珠菌。
② 生化方法：
形态学无法鉴定的菌种可使用Vitek YST鉴定卡以及API 20C生化鉴定系统鉴定。操作方法见该产品使用说明书。
（二）隐球菌属（Cryptococcus）的鉴定：
隐球菌较念珠菌少见，但由新型隐球菌引起的脑膜炎却是一种严重的疾病。该菌存
在于鸽粪、土壤、腐烂的水果中，亦见于动物和人体。主要侵犯中枢神经系统，也可以
侵及肺、骨、皮肤，甚至引起败血症。其他隐球菌也可引起严重的临床感染。
1. 镜下特征：
① 直接镜检：标本一般为脑脊液、痰或其他分泌物。镜下可见
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圆形5-12-20μm直径之厚
壁芽生孢子，一般少有假菌丝；
② 革兰染色：为革兰阳性圆形芽生真菌孢子。注意勿将其误作染料小滴。
③ 墨汁染色：如有新型隐球菌，在黑色背景下可见圆形孢子，其周围绕以透光的厚荚膜，
厚度可与菌体直径相当。菌体的大小和荚膜的宽窄在同一张片子上可有较大
不同。有时可看到出芽的孢子。注意切勿将淋巴细胞误认为新型隐球菌。
新型隐球菌在墨汁涂片中的形态可归纳为：
●圆形或卵圆形的孢子，胞壁厚，边缘清晰，用微调节观察似有双圈；
●孢子周围有透亮的厚荚膜，孢子与荚膜之间的界限和荚膜的外缘都非常整齐、清楚；
●孢子内有反光颗粒；
●有的孢子有芽生出，且芽颈甚细。
注意：任何圆形物体边缘模糊，内部无反光颗粒，外部有较窄、内外界线不清的透亮环
者，不是隐球菌。但应注意新型隐球菌以外的其他隐球菌也有荚膜。
2. 生化鉴定：
使用Vitek YST鉴