试验二水稻WRKY基因PCR扩增及其检测.docx

文档介绍：实验二 水稻 WRKY 基因 PCR 扩增及其检测
一、背景知识
PCR （Polymerase Cha in Reaction 即聚合酶链式反应，是当前分子生物学最基就可获得更多的“半保留
复制链”，而且这种新链又可成
为下次循环的模板。每完成一个循环需
2? 4分钟，2? 3
小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、 实验目的
了解 PCR 的原理，掌握 PCR 的基本操作方法。
四、 主要材料、试剂与仪器
DNA 模板（即 实验一抽提获得的水稻总 DNA ）
10>PCR buffer 、MgCb （25 mM ）、dNTPs （ mM ）、引物（10 卩 M） Taq 酶（ 5 U/ Jl 无菌水、 1 kb marker 、琼脂糖、6 电泳上样缓冲液、 50 X TAE 电泳缓冲液、 溴化乙锭 EB 、 TE 缓冲液。
碎冰、 ml PCR 薄壁管、普通台式离心机、 移液枪及 Tip 头、PCR 仪、锥形瓶、 量筒、
电子天平、微波炉、电泳槽、电泳仪、紫外成像仪、比色杯、紫外分光光度计。
五、实验内容和方法
（一） 水稻基因组 DNA 的检测
1） DNA 溶液稀释 20-30 倍后，测定 OD 260/O D280 比值，明确 DNA 的含量和质量。
OD 260/OD 280 " ,
若大于 , 说明有 RNA 污染；小于 ，有蛋白质污染。
样品浓度 （mg/ml ）=OD260 X 稀释倍数 >50
（2）取 2 T 在 % Agarose 胶上电泳，检测 DNA 的分子大小。
1） 取 150 ml 锥形瓶，用电子天平称取琼脂糖
g ；
2） 加入 1 XTAE 电泳缓冲液 50 ml （即 % 琼脂糖 ） ；用微波炉融化，混匀；
3） 准备胶板，置梳子，倒胶约 25 ml （50-60 （C），冷却凝固；
4） 置胶板于微型电泳槽后，倒入 1XTAE电泳缓冲液；
5） 点样，电泳（ 55 V / 40 min ）；
6） 紫外成像并分析。
（二） 水稻 WRKY 基因的 PCR 扩增
1）建立 PCR反应体系
在 ml PCR 管中建立 25 pl 总反应体系，置冰浴加各组分：
10 X PCR buffer
p
MgCl 2 （25 mM ）

J
dNTPs （ mM ）

J
正向引物 （10
側）

J
反向引物 （10
側）

J
J

J
Taq 酶（ 5 U/
）
模板 DNA
1