文档介绍：宏基因组实验计划
1１）
重复 (8)、 (９ )、 (1０)一次 ;
(12)
将三次提取所获上清液与等体积的苯酚
:氯仿 (1:１ v/v) 混合 ,摇匀后于 4 ℃
12，０ 0０ g 离心 10 min ；
(１ 3)
将上层水相转移至一新的
50 ｍｌ 离心管中 ,加入等体积的氯仿：异戊醇（
24:１ )，
混匀后于
4 ℃ １２ ,000g 离心 10 miｎ；
（14）
再次转移上清至一新的离心管中，加入
倍体积的异丙醇于室温沉淀
1 h;
(１ 5） 室温 12,00０ g 离心２０ min ；
收集沉淀 ,用预冷的 70%乙醇洗涤沉淀；
向离心管中加入１ ml T Ｅ，于 4 ℃ 放置过夜 ,分装保存于‐ 20 ℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧 :??(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔 ,避免剧烈震荡 (试剂
盒提取除外 )。 2(?） 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉 ,避免机械剪切。 ?( ３)酚氯仿抽
提时 ,中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4） 异丙醇沉淀时不要放在低温 ,０ .7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) Ｄ NA 溶解时可以放在 4℃ 静置过夜 ,次日离心取上清去除多余杂质。 ?(6) 水平震荡
可以用左右摇晃的震荡器。
水样 D ＮA 间接提取法 :
抽滤的方式浓缩采集到的水样。
（2) 采取差速离心取得水样中的菌体。
（3) 取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如 :用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有Ｄ N Ａ的丢失等等。
Ｅｐｉ cｅｎ tre 推出了宏基因组 DNA 分离试剂盒（ M ｅｔａ gｅ nｏｍ i ｃ DN Ａ Ｉｓ oｌ a
ｔion Kit for
Watｅ r), 能从水样中分离已随机剪切的
,可直接用于
fosmiｄ克隆的
D ＮA
片
段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物 (包括革兰氏阳性菌 )中提取
DNA 。提取的 DN Ａ可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Ｅ
１ＦＯ S 载体上。
4０ｋ b
piceｎ tre
大小的
的Ｐ CC
优势 :
１．无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。
/氯仿提取。
，从低丰度的微生物中回收
4． Fosｍｉｄ载体与 D ＮA 的克隆只需要
DNA 90
的概率更大。
分钟。
下图为方法与流程：
粗提 D ＮA 的纯化
采用直接提取法提取的总 DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生
物学操作会有影响 ,时常会导致ＰＣ R 扩增不出来 ,酶切困难 ,连接转化率低。需要进行纯化。
纯化的方法包括 :胶回收，柱纯化 ,电泳 /电洗脱，梯度离心。
a 胶回收
胶回收最大的优点在于快捷 ,可以在很短的时间内完成。纯化后的 DＮ A 往往能够满足Ｐ
CR 要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对 DＮ A 分子造成机械损伤 ,使得
DN Ａ 弥散，完整度下降。 如果后续的实验室分析 16S r DNA, 则这种纯化方式不失为一种好
方法。
?
b 柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速 ,十几分钟内可完成。与胶回收相比，其纯化效果要差一
些。但通常情况下， 纯化之后的Ｄ NA 也能够满足Ｐ CＲ 需求。这种方法也会造成Ｄ NＡ 分子的机械损伤，使得 DNA 弥散 ,完整度下降。 ?
电泳／电洗脱
电泳／电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一 ,其价格低；其二 ,整个过程都很温和 ,能够保证 DNA 的完整性 ;其三 ,