文档介绍：实验二 总糖和复原糖的测定 (3，5～二硝基水杨酸法)
?食品生物化学实验?课程
掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和复原糖含量的根本原理，学会处理721型或722型分光光度计出现的问题
一、实验目的
实验二 总糖和复原糖的测定 (3，5～二硝基水杨酸法)
?食品生物化学实验?课程
掌握3，5～二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和复原糖含量的根本原理，学会处理721型或722型分光光度计出现的问题
一、实验目的
二、实验原理
复原糖的测定是糖定量测定的根本方法。复原糖是指含有自由醛基或***基的糖类，单糖都是复原糖，双糖和多糖不一定是复原糖，其中乳糖和麦芽糖是复原糖，蔗糖和淀粉是非复原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有复原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有复原性的单糖进行测定，再分别求出样品中复原糖和总糖的含量〔复原糖以葡萄糖含量计〕。
本实验是利用3，5～二硝基水杨酸溶液〔DNS法〕与复原糖溶液共热后被复原成棕红色氨基化合物，在一定范围内复原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。
三、实验步骤
1、葡萄糖标准曲线的制定
葡萄糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖〔预先在105℃枯燥至恒重〕，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。
取7支25×250mm的试管，分别按下表参加试剂：
管 号
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准液（ml）
0
相当于葡萄糖量(mg)
0
蒸馏水（ml）
3,5二硝基水杨酸(ml)
将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，，摇匀。于520nm波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品中总糖和复原糖含量的测定
〔1〕样品中复原糖的提取：
准确称取10g新鲜材料〔或2g材料干样粉末〕，放在100ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20min，过滤，将滤液收集在100ml容量瓶中，再定容至100ml。
〔2〕样品中总糖的水解提取：
准确称取10g新鲜材料〔或1g材料干样粉末〕，放在锥形瓶中，参加10ml 6 mol•L-1 盐酸，15ml水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，那么不呈现蓝色。冷却后参加1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。
〔3〕样品中糖含量的测定： 取7支25×250mm试管分别按下表参加试剂：
管 号
空白
还原糖
总糖
0
1
2
3
1
2
3
样品溶液（ml）
0
蒸馏水（ml）
2
3,5二硝基水杨酸(ml)
OD
加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。
四、实验结果
在Excel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。
以表格形式列出实验数据，取样品的OD520平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中复原糖与总糖的含量。
还原糖（mg•g-1）=
还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数
测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）
总糖（mg•g-1）=
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数
测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）
五、讨论分析
1、在被测样品中，复原糖可能是些什么糖？总糖包括哪些？
2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
3、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？