文档介绍：蛋白质核酸沉淀分离技术
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沉淀和结晶的区别:
形态
成分纯度
结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出；
沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。
操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理
亲水胶体在水中的稳定因素
电 荷
水化膜
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等点电时的蛋白质（亲水胶体）
带负电荷蛋白质（亲水胶体）
脱水
脱水
脱水
带负电荷蛋白质（疏水胶体）
不稳定蛋白颗粒
阴离子
阳离子
碱
酸
酸
蛋白质聚集沉淀
带正电荷蛋白质（亲水胶体）
碱
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+
水化膜
带正电荷蛋白质（疏水胶体）
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由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化膜，暴露出疏水区域。
同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
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选用盐析用盐的几点考虑：
盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
2、中性盐的选择
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阴离子：
柠檬酸根-3>酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-
阳离子：
Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>
Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+
Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。
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常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4)2SO4
103
Na2SO4
NaH2PO4
101
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（1）溶解度大
（2）分离效果好
（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
（4）价格便宜，废液不污染环境。
最常用的盐：硫酸铵
缓冲能力弱，具腐蚀性，含N
缺点
优点
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（1）加入固体盐法
3、 盐析的操作方法
适用：饱和度高，不增大溶液体积
加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表时
注意温度
饱和度：
在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。
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（1）加入固体盐法
20℃
25℃
g ：加入固体硫酸铵的质量
S2：所需达到的硫酸铵饱和度
S1：原溶液的硫酸铵饱和度
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（2）加入饱和溶液法
适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。
V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；
V0：原溶液体积；
S2：所需达到的硫酸铵饱和度；
S1：原溶液的硫酸铵饱和度。
饱和硫酸铵的配制方法
在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。
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优点
硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。
缺点
硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。
（3）透析平衡法
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方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃
4、盐析曲线的制作
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）
以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线
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蛋白质量(mg)或酶活力
硫酸铵饱和度％
蛋白质量(mg)或酶活力
硫酸铵饱和度％
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方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线
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