文档介绍：广东省高教厅重点实验室－ 现代生物技术实验室实验教材
基因工程技术实验指导
(研究生教材)
的提取方法。
二、原理
质粒 DNA 的提取常用碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、 Triton- 溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常
用。本方法有质粒 DNA 产量高、 快速等优点。 其原理为 : 在碱性溶液中， 双链 DNA 氢键断裂， DNA
双螺旋结构遭破坏而发生变性， 但由于质粒 DNA 分子量相对较小， 且呈环状超螺旋结构， 即使在高
碱性 pH 条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒 DNA 又恢复到原
来的构型；而线性的大分子量细菌染色体 DNA 则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、 SDS 等形成不
溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体 DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒 DNA 及
小分子量的 RNA 则留在上清液中。混杂的 RNA 可用 RNA 酶 (RNaseA) 消除。再用酚 /***仿处理，可
去除残留蛋白质。
三、实验材料
含质粒 pBluescript II 的大肠杆菌 DH10B 。
四、仪器设备
高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床
台式离心机（冷冻式或非冷冻式） 旋涡振荡器
五、实验用具
培养用试管
微量离心管
量筒
微量取液器
冰盒
吸管头若干
六、试剂
(配制方法见附录
)
LB 培养基
溶液 I；
氨苄青霉素 (Amp, 100 mg/ml)
溶液 II( 最好现配现用 )；
20% SDS
溶液 III(-20
℃预冷
)
4 N NaOH
3 M NaAc()
无水乙醇
TE
缓冲液
(pH )
RNase A(10 mg/ml)
70%乙醇
饱和酚指已加入了
/***仿 /异戊醇 (25:24:1 ，注：在本实验指导的其它章节省略为“酚
1/24 体积的异戊醇 )
/***仿”，而“***仿”均
七、实验步骤
细菌的培养
配制 LB 液体和琼脂培养基，并高压灭菌。
(2)
在含 Amp 100 g/ml 的琼脂培养基平板上 (划线或涂抹 )培养出单菌落 (37℃， 18~20 小时 )。
(3)
在培养管中加入含 Amp 100 g/ml 的 LB 液体培养基 (4~5 ml/ 管 )，挑取单菌落至培养基中。
将培养管倾斜插在摇床中，
37℃摇过夜 (约 200 rpm， 14~16 小时，一般不超过 18 小时 )。如
需大量提取，挑取单菌落至接入含
50 ml LB 培养基的三角瓶中， 37℃摇 18 小时。
质粒 DNA 的抽提
（如使用冷冻离心机，设为4℃预冷）
吸取 ml 菌液至 ml 离心管中。
离心 (5000 rpm, 2 分钟 )，弃上清液。如想提取多一点 DNA ，再吸取 ml 菌液至同一离心管中，
离心，弃上清液。
用移液器 尽可能除去上清液 。加入 150 l 溶液 I ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
加入 250 l 溶液 II ，缓慢地上下翻转离心管 10 多下， 温和混匀 。室温下放置 5 分钟 。
加入 180 l 预冷的溶液 III ，上下翻转离心管 10 多下，温和混匀 ，冰浴 10 分钟，或放入－ 20℃
冰箱 5 分钟（避免过长时间产生冻结） 。
离心 (12000 rpm， 5 分钟， 4℃ )。（离心完后把离心机温度设为 20℃）。
移取上清液。加 2/3 倍体积的酚 /***仿抽提，离心 (12000 rpm， 5 分钟 )。
移取上清液（约 500~550 l），加 2 倍体积无水乙醇（大量提取时上清液的容量大，可用
倍体
积异丙醇代替乙醇） ，混匀。
离心（ 12000 rpm ， 5 分钟，室温 )，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液器 尽可能除去酒精。
用 ml 70 ％酒