文档介绍：基因工程及其应用
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基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（重组DNA 技术）；下游技术涉及到基因工程菌或细胞的大页。
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粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。
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Sel I CGCG
Tha I CG CG
Sau3A I GATC
CTAG
BamH I GGATCC
CCTAGG
同裂酶(来源不同但识别相同靶序列)
同尾酶(来源不同，识别靶序列不同但产生相同粘性末端)
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4、限制片断的末端连接作用
分子间的连接：不同的DN***断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。
分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
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5、影响核酸内切酶活性的因素
⑴DNA的纯度
DNase的污染(Mg2+)
（稀释）
加入亚精***提高酶的消化作用，需适当的温度。
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⑵DNA的***化程度
⑶酶切消化反应的温度
大多数酶的标准反应温度37℃。
⑷DNA的分子结构
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。
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⑸核酸内切限制酶标准的缓冲液
ａ. ***化镁、***化钠或***化钾：
不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。
ｂ. Tris-HCl ：
维持最适的pH值（ pH ＝）。
ｃ. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ：
维持酶的稳定性。
ｄ. 牛血清蛋白（BSA） ：维持酶的稳定性。
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６、核酸内切限制酶对DNA的消化作用
⑴核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。
⑵核酸内切限制酶对DNA的局部消化
完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。
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局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。
a. 缩短酶切的消化反应的保温时间
b. 降低反应的温度（37--4）结束酶的活性
⑶核酸内切限制酶对生物基因组的消化作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片断）
大分子量的片断-----多（基因文库）
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（二）其它工具酶
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１、末端核苷酸转移酶（terminal transferase）
能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。
它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA或双链DNA。
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用途：
ａ. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DN***断的3’ 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。
ｂ. 催化非放射性的标记物掺入到DN***断的3’-末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生素蛋白结合物的接受位点。
ｃ. 用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。
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２、碱性磷酸酶
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DN***段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。
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３、S1核酸酶
来自于稻