分子荧光分光光度法实验技术.ppt

文档介绍：分子荧光分光光度法实验技术
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分子发光分析法
分子发光分析包括:
荧光分析（fluorescence analysis）
磷光分析（phosp的荧光物质，以提高分析的效果。
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3）物质的分子结构和荧光的关系
物质的分子结构与荧光的发生及荧光强度的大小紧密相关。
分子产生荧光必须具备2个条件：
（1）物质分子必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构
（2）物质分子吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率。荧光效率大，在相同的浓度下，荧光的发射强度也大。
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3）物质的分子结构和荧光的关系
1、具有共轭双键体系的分子。共轭程度越大，分子的荧光效率越大。
2、具有刚性平面结构的分子。刚性的不饱和的平面结构具有较高的荧光效率，分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高。
3、苯环上取代基的类型。给电子基团常使荧光增强，吸电子基团及卤素会减弱甚至破坏荧光。
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4）环境对荧光的影响
分子所处的环境，如温度、溶剂、PH值等都会影响分子结构和立体构像，从而影响荧光强度 。
（1）温度：一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加；相反，温度升高荧光效率将下降 。
（2）溶剂：同一种荧光物质溶于不同的溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显的不同。一般情况下，随着溶剂的极性增加，荧光强度将增强。
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4）环境对荧光的影响
（ 3）溶剂PH值的影响，当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶剂PH值对荧光强度有较大影响。
（4）猝灭剂的影响，荧光猝灭是指荧光物质与溶剂子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈线性的关系的现象。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂（quencher）。常见的猝灭剂有卤素离子、重金属离子、氧分子、以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。
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五、荧光分光光度计的结构
发光源：采用高压氙灯。
试样池：荧光分析用的试样池需用低荧光材料，常用石英池，形状为四面透光的方形。
检测器：荧光的强度比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度，常用光电倍增管。
单色器：采用光栅作为单色器。
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六、荧光的定量分析
1、荧光测定的线性范围一般在10-5~100μg/ml。当浓度较高时，吸光度（A）〉，由于自猝灭和自吸收等原因，荧光强度与浓度不呈线性关系，荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离，发生负偏差。
2、与紫外-可见分光光度法相同，也可采用标准曲线法和标准对照法。
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六、荧光的定量分析
3、测量条件的选择
选择线性范围：当荧光物质溶液的吸光度A≤，荧光强度与浓度才呈线性关系。
选择合适的激发光和荧光波长：一般选择激发光谱中能产生最强荧光的入射光波长作为激发光，荧光光谱选择最强荧光的波长作为荧光测定的波长。
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七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光
扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采集速率达80次/秒
波长范围：190-1100 nm
光谱带宽：、、5、10和20 nm五档切换
具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
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八、荧光分光度计的使用
1、开启计算机，键入用户名和密码，打开分光光度计主机，运行Cary Eclipse软件。
2、按样品的测定要求进入相应的测定模块。
3、设定测定参数，按操作流程测试样品，测定结果保存或打印。
4、测试完毕后，在系统指定的出口退出系统；先关闭分光光度计主机电源，再关闭电脑，切断总电源。
5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登记本上填写使用记录。
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操作软件包
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定性分析操作
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预扫描
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移除谱图
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