文档介绍：2020
第四章核酸电泳与检测
（4）凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关
一、凝胶类型
～50Kb之间(＜20kb);可区分相差loobp的DN***段，
常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 ,有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。
电泳缓冲液TAE TBE TPE三者区别
（1）缓冲容量：TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化。
TBE和TPE比TAE花费贵，但有高得多的缓冲容量。
（2）迁移速度：双链线状DN***段中TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%，
（3）分辨率：对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。
TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液
（5）溴化乙锭
    在DNA电泳中,溴化乙锭染料可插入到碱基对中,从而增加线性及开环DNA的长度。加溴化乙锭后进行电泳,可使DNA的泳动速度降低达15%。
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热至90℃左右,即可熔化形成清亮、透明的液体,待冷至40-45℃时则可固化形成凝胶 。
基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套
（1）琼脂糖凝胶电泳的基本过程
上样缓冲液的三个作用
（1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内
（2）使样品带有颜色便于简化上样过程
（3）其中的染料在电场中可以预测泳动速率向阳极迁移。
6*上样缓冲液成分：
（2）琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。
凝胶的EB染色
（1）EB被认为是一种强致癌物质,见光分解。
（2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中， μg/ml 。
（4）当要知道DN***段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。
EB替代品
SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。
sybr-green、sybrgold ---- 不稳定，毒性也很大
goldview ----宣称无毒,不灵敏,回收连接不好,荧光易猝灭。对于大片段DNA的染色效果还凑合，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好。
GelRed/GelGreen低毒,效果很强!但价格昂贵。
（3）结果分析
提取细菌基因组电泳图
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中
DNA Ladder的形成
PCR产物的电泳
RNA电泳图
1、溴乙锭(EB)是诱变剂 ，应戴乳胶手套。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品,必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。
    2、加样量的多少决定于加样孔最大容积。加入样品的体积应略少于加样孔容积。
DNA带很淡或无带
DNA带拖尾
紫外吸收法、定磷法
（1）目测条带亮度来判断DNA浓度 跑胶时候marker 按说明书的量上样电泳，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和marker 条带的亮度做个大致的比较。        找出两者最接近亮度的条带。根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，如果质粒的量很浓的话。
（2）分光光度法
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。
波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。
对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝
当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml