文档介绍：实验目的
了解碱法提取质粒的原理；
掌握碱法提取质粒的方法；
掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
第一页，共二十五页。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. RNaseA
将RNA 酶 A溶于10 mmol/L (pH )、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。
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实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。
2. ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上清液。
3. 加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。
4. 加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻），冰上放置5min。
5. 加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀（注意动作轻） ，冰上放置5min。
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6. 15,000rpm，离心10min， ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ） 。
7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
8. ml Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
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9. ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃离心，15,000rpm，10min。
10. 弃上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀， 4℃离心，10,000rpm，5min。
11. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。
12. 加入50 l TE buffer，室温振荡溶解质粒DNA。
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培养细菌使质粒扩增
1. 挑取琼脂培养板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp100 g/ml) 37℃摇荡培养过夜。
2. 取1ml菌液转接到一个含有100 ml LB培养液三角瓶中(含 Amp100 g/ml ）, 37℃摇荡培养过夜。
37℃
振摇过夜
37℃
振摇过夜
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Tiangen质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用）
操作过程
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的平衡液BL，12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2. 将1-2ml 离心管中，12,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。
3. 加200 l 溶液P1（用前检查是否已加入RNase A），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
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4. 加200 l 溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被打断，注意不要让反应持续超过5 分钟。
5. 加300 l 溶液P3，立即轻柔颠倒离心管6-8 次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。
6. 12,000rpm离心10 分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。
7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内液体。
8. 向吸附柱CP3 内加600 l漂洗液PW ，12,000rpm 离心30-60 秒，并弃去收集管内废液。
9. 重复第8 步一次。
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放入收集管中，12,000 rpm 离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附