文档介绍：实验 双缩脲法测定蛋白质浓度
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一、实验目的
3. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
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比色皿架，并将其推或拉入光路
④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零
⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。
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光路
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光路
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微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量
被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，，便得到该样品的蛋白质含量。
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Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。
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紫外分光光度法测定蛋白质浓度
由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
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总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；Micro -20μg/ml
快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便
经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量
不受样品中离子型和非离子型去污剂影响
检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
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基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
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考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。
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Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
+
Amax = 595nm
BLUE
Acid
Coomassie G-250
Protein - Dye
Complex
O
CH
2
CH
3
NH
C
CH
3
CH
3
N
CH
2
SO
3
-
CH
3
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
3
SO
3
Na
+
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（二）双缩脲法测定蛋白质
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3