文档介绍：色谱基础知识
第1页，共41页，编辑于2022年，星期二
一、色谱起源
色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色寸 填料床的长度和内径
粒径 平均颗粒直径，通常3-10μm
孔径 颗粒的孔或者腔的平均尺寸，范围80-100A
封尾 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来
第16页，共41页，编辑于2022年，星期二
色谱中常用的术语
色谱图 组分从色谱柱流出并通过检测器时所产生的响应信号的微分曲线
第17页，共41页，编辑于2022年，星期二
基线 正常情况下，仅有流动相通过检测线时所产生的响应信号的曲线。
峰高（h） 峰最大值到峰底的距离
峰宽（W） 峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰高一半处的峰宽叫半高峰宽（W ½h）
死时间（t0）实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间
保留时间（tR）从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间,称为此组分的保留时间
调整保留时间 (t'R)扣除死时间后的保留时间 t'R= tR-t0
容量因子（k） k= t'R ／t0 k值越大，组分出柱越慢，保留时间越长
第18页，共41页，编辑于2022年，星期二
第19页，共41页，编辑于2022年，星期二
柱效
柱效简而言之就是色谱柱对色谱中物质分离能力的大小。柱效越高，分离效果越好，峰形越好。色谱柱的柱效和填料、柱长、柱内径均有关系，一般来说，填料越细密、柱长径比越大，柱效越高。柱校的衡量用理论塔板数来表示。
理论塔板数（n） n=×(tR/ W ½h)2
n=16×(tR/W)2
理论塔板高度（H） H= L/n L:色谱柱长
第20页，共41页，编辑于2022年，星期二
分离度（R) R= 2（tR2-tR1）/（W1+W2)
相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰宽总和一半的比值。
R<1时,两峰有部分重叠
R=1时,分离程度可达98%
R=,%，可认为两组分完全分离
增加柱长可以提高分离度，但延长了分析时间
第21页，共41页，编辑于2022年，星期二
拖尾因子（T） T= /
5%峰高处峰宽 5%峰高处的前半峰宽
中国药典》～。T<，T>。
第22页，共41页，编辑于2022年，星期二
色谱图的峰位置用于定性，色谱峰的峰高和峰面积用于定量，峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。
第23页，共41页，编辑于2022年，星期二
流动相
流动相选择注意事项：
纯度：采用“ HPLC ”级溶剂
避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂
对试样有适宜的溶解度
溶剂粘度要小
与检测器相匹配
第24页，共41页，编辑于2022年，星期二
溶 剂 等 级
水的等级
纯化水
蒸馏水
去离子水
波长 (nm)
纯化水
去离子水
因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
吸光率
第25页，共41页，编辑于2022年，星期二
HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：
1 专门的纯水机或超纯水机；
2 去离子水重蒸；
3 二次或三次重蒸水；
4 采用类似家用的纯水机；
5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；
6 其它途径；
第26页，共41页，编辑于2022年，星期二
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。
，，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
第27页，共41页，编辑于2022年，星期二
溶剂前处理
过滤：
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
第28页，共41页，编辑于2022年，星期二
滤膜类型：
聚四***乙烯滤膜：
适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
醋酸纤维滤膜：
不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。
尼龙66滤膜：
适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二***甲烷、不适用于二***甲酰***。
再生纤维素滤膜：
具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
第29页，共41页，编辑于2022年，星期二
溶剂前处理
脱气
目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡
一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能