文档介绍：转基因的方法和原理
第1页，共53页，编辑于2022年，星期三
简介
转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DN***段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。
转基因通过获取基因、重组基因和表达，星期三
质粒载体pBR322
，含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因
，还具有BamH I、Hind Ⅲ和Sal I 三个识别位点。
I识别位点在氨苄青霉素抗性基
，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。
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pUC19质粒
长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的调节片段，一个调节lac Z’基因表达的阻碍蛋白的基因lac I，还有多个单克隆位点。
pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色，如果插入有目的DN***段，无法形成杂合β－半乳糖苷酶，菌落时白色的。
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λ噬菌体
λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环
在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N）与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关，因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克隆外源DNA，右边的基因涉及λ基因的表达、调节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。
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λ噬菌体载体
分类：插入型载体和置换型载体。
插入型载体：具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。
置换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DN***段，可被外源DN***段置换。
λ噬菌体载体可以克隆较大DN***段，最大长度约为24kb，只需将λ噬菌体DNA、尾巴和纯化的空的头，混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒。
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柯氏质粒 Cosmid
柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DN***段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。
柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。
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分离基因
克隆到某中间载体
转化大肠杆菌
提取质粒
限制酶切/连接
克隆到植物表达载体
转化农杆菌
基因枪转化
pKS,pBR332,pGEM-T
JM109, TOP10…
HindIII/EcroI… T4 ligase
pBI121, pCAM1001…
LBA4404, EHA
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几种有效的转基因方法
基因转移（transgenosis）是借助于物理、化学或生物的手段将外源基因导入受体细胞，并检查其在该细胞内表达情况的一种技术，是细胞工程中一项重要而应用广泛的技术。
细胞直接摄取外源DNA的过程称为转化（transformation），如果通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程，称为转导(transduction)
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基因转移的方法
<10－6
≤10－6
<10－6
≈2×10－4
10－3－10－7
≈1－10％
10～30％
，超声波介导的基因转移
10～50％
≈10～100％
≈100％
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DNA-磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀反应是将外源DNA转移并整合到细胞株中去的最常用方法，主要用于将基因导入动物细胞。
由于核酸以磷酸钙－DNA共沉淀物的形式存在，培养细胞对DNA的吸收会大大提高，细胞通过内吞作用，使DNA进入细胞质，并转移整合到细胞核内的染色体内。
一般是将DNA与Ca