文档介绍：动物细胞培养技术
［实验目的］学****掌握细胞培养的基本原理以与具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养;掌握无菌操作的具体过程与无菌操作台的使用；学****掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理与方法；学****使用血球计数板对细胞总数与活细胞数进行计数，计算步骤］（一）小鼠脾脏细胞的培养1）.取材：
取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酉精中灭菌3min,取出转入超净工作台的解剖盘，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镶起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2）.分离脾细胞：
用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，以3000转/分离心1-2min。
3）.培养脾细胞：
从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml,并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台打开弃去上清液，用"枪（200l）”吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37C,5%勺二氧化碳培养箱中培养。
（二）.台盼蓝法坚定细胞的死活1）试剂配制：
%台盼蓝染液，备用。
2）细胞悬液制备：
将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）%胰蛋白酶/%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min,待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。
3）染色制片：
，加1-2滴（）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。
4）染色结果：
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
（三）.血球计数板进行细胞计数1）染色计数：
，加1-2滴（）染液，混合使悬液自然充满计
10物镜下计数
以如下公式计算细胞
2-5min,滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，数板小室（注意：不要使小室有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜四个大格的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。
2）根据染色结果计算活细胞率：
依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，存活率:
活细胞率（%）
细胞总数-死细胞数
细胞总数
100%
每毫升液体中细胞的数=每个大方格中的细胞数量*10000*稀释倍数
［实验结果］
从培养箱拿出的培养基在倒置显微镜下可以清晰的看到培养的细胞，细胞呈圆形，形状规则，聚集在一起，有立体感。
10倍物镜
左上
右上
中间
左下
右卜
活细胞数
5
3
5
6
6
死细胞数
26
26
28
25
29
细胞总数
31
29