文档介绍：第三章核酸的分离与检测
从哪儿提取（Where）？
怎么提取（How）？
提到什么程度（What）？
会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？
核酸提取的原则和基本要求
核酸提取的一般过程
关键试两条互补链不会完全分离，当以pH ，变性的质粒DNA完全复性，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构
——碱变性法（for plasmid DNA）
DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解， mol/L的***化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L***化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，***化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
——浓盐法
高温变性
低温复性
——沸水浴法（for plasmid DNA）
核酸的常用提取方法
常用的DNA提取方法
浓盐法
阴离子去污剂法
苯酚抽提法
水抽提法
沸水浴法
碱变性法
1. 浓盐法
原理： 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；
常用的方法：用1M ***化钠提取***化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的***仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及***仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来（ MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按***仿---异醇法除去蛋白）。
1. 浓盐法
注意
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在***,,并称SSC溶液,提取DNA.
2. 阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.
3. 苯酚抽提法
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。
利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
4. 水抽提法
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液；
在上清中加入固体***。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出；
然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及***洗涤；
最后在空气中干燥,既得DNA样品。
此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。
5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）
1. 在Eppendorf管中加入110 ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml）（蔗糖 8％ ，Triton X-100 5％，Tris-HCl ()  50 mM， EDTA ()  50 mM）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。       
2. 上述菌体悬浮液沸水煮30秒。
3. 迅速放置于常温下15000 rpm离心15分钟。
5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）
4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml的异丙醇，充分混匀后4℃，15000 rpm离心20分钟。       
5. 弃上清液，加入70%冰乙醇400 ml，4℃，15000 rpm离心5分钟。       
6. 沉淀凉干后用50 ml无菌重蒸水溶解。       
7. 取5 ml电泳检测。
6. 碱变性法
原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在高pH值条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；
当pH值调至至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－S