文档介绍：第四章 酶联免疫吸附试验
第一节 ELISA的类型
第二节 ELISA需要的仪器及耗材
第三节 ELISA需要的试剂
第四节 ELISA操作步骤
第五节 ELISA结果判断
-杨继红
前言
酶联免疫吸附试验英文为Enzyme体通过物理吸附与固相载体联结，形成固相抗体，保持其免疫学活性。洗涤除去未结合到固相的抗体及杂质。
同时加入待检测标本和酶标记抗体，在合适温度下保温，让标本中特异性的抗原同时与固相上结合的抗体及酶记标抗体反应，在固相上形成包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
加入底物，在固相上的酶催化作用下无色底物成为有色产物，显现颜色。
根据颜色有无来判定标本中是否有抗原存在，有颜色结果为阳性，表示标本中有抗原。根据颜色深浅来判定标本中抗原量的多少，颜色深浅与酶结合物量，即标本中相应抗原量成正比。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
一步法影响因素
前带现象
类风湿因子（RF）干扰
-杨继红
第一节 ELISA的类型
前带现象
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物”。此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的 吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为前带效应（pre-zone effect），严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
如何消除前带现象的影响
在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液HCG等）时，应注意一步法检测范围的最高值。
如果样品浓度超过检测最高值，可以将样品作适当稀释以后检测。
常规双抗体夹心ELISA无前带现象。
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱前带现象。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
类风湿因子（RF）干扰
RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可像抗原一样，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。
消除：采用F（ab′）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
2、双抗原夹心ELISA测抗体
抗原包被固相载体
加入标本
加入酶标抗原
加入底物显色
判断结果
将特异性抗原通过物理吸附与固相载体联结，形成固相抗原，保持其免疫学活性。洗涤除去未结合到固相的抗原及杂质。
加入待检测标本，在合适温度下保温，让标本中特异性的抗体与固相上结合的抗原反应，在固相上形成抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
加酶标记抗原，在合适温度下保温，让酶标记抗原与固相上免疫复合物中的抗体反应。在固相上形成包被抗原-抗体-酶标记抗原复合物。彻底洗涤未结合的酶标记抗原。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗体的量相关。
加入底物，在固相上的酶催化作用下无色底物成为有色产物，显现颜色。
根据颜色有无来判定标本中是否有抗体存在，有颜色结果为阳性，表示标本中有抗体。根据颜色深浅来判定标本中抗体量的多少，颜色深浅与酶结合物量，即标本中相应抗体量成正比。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
二、间接 ELISA （Indirect ELISA）
抗原包被固相载体
加入标本
加入酶标抗抗体（二抗）
加入底物显色
判断结果
将特异性抗原通过物理吸附与固相载体联结，形成固相抗原，保持其免疫学活性。洗涤除去未结合到固相的抗原及杂质。
加入待检测标本，在合适温度下保温，让标本中特异性的抗体与固相上结合的抗原反应，在固相上形成抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
加酶标记二抗，在合适温度下保温，让酶标记二抗与固相上免疫复合物中的抗体反应。在固相上形成包被抗原-抗体-酶标记二抗复合物。彻底洗涤未结合的酶标记二抗。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗体的量相关。
加入底物，在固相上的酶催化作用下无色底物成为有色产物，显现颜色。
根据颜色有无来判定标本中是否有抗体存在，有颜色结果为阳性，表示标本中有抗体。根据颜色深浅来判定标本中抗体量的多少，颜色深浅与酶结合物量，即标本中相应抗体量成正比。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
间接 ELISA特点
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
-杨继红
第一节 ELISA的类型
间接 ELISA影响因素
抗原的纯度
正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG
虽然有时用粗提抗原包