文档介绍：第九讲基因操作的工具酶详解演示文稿
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优选第九讲基因操作的工具酶
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一. 基因工程工具酶的概念
在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶制性内切酶
R
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最常用的限制性核酸内切酶
二. 限制性内切酶
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－修饰系统
为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？
因为几乎所有的限制性内切核酸酶都要和能识别而且***化相同DNA位点的***化酶共同作用
这两个酶：限制性内切核酸酶和***化酶一起称为限制－修饰系统。宿主细胞中***化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化
二. 限制性内切酶
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限制性核酸内切酶EcoR I及
修饰的***化酶MEcoR I的限制与修饰作用
二. 限制性内切酶
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根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶
I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有***化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大
II型酶切割DN***断活性和***化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用
通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的
二. 限制性内切酶
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二. 限制性内切酶
R
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采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名
用来源细菌的英文缩写斜体符号命名
它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母
第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母
第四个字母代表菌株
最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号
二. 限制性内切酶
R
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前3个字母来自产生菌－流感噬血菌的拉丁名
“H”来自属名Haemopbilus的第一个字母
“in”来自种名influenzae的前两个字母
“d”来自菌株名Rd的d
“III”说明是在该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶
Hind III为例
二. 限制性内切酶
Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌（Haemophilus influenzac）d株中分离到的第3个限制酶
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名属种株序来源
称名名名号菌株
EcoRⅠ E co R Ⅰ Escherichia coli R

Hind Ⅲ H in d Ⅲ Haemophilus influenzae d

HindⅡ H in d Ⅱ Haemophilus influenzae d

HpaⅠ H pa / Ⅰ Haemophilus parainfluenzae a
二. 限制性内切酶
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分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8
NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用
对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度
二. 限制性内切酶
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能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的基础
通常是由4-6个碱基对组成的具有回文序列的DN***段，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键
二. 限制性内切酶
1) 每一种酶都有各自特异识别位点
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不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对
识别序列碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低
不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同
二. 限制性内切酶
识别序列的频率=1/4N
Sau3A(4bp)：1/44=256bp
EcoRI、PstI(6bp)：