文档介绍：离心技术与细胞器分离
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一 实验目的
1、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握离心机的操作技术及两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯度离心法;
2、光镜鉴定各种细胞器的10万转/分以上
离心机的基本分类
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离心机的结构
离心机的主要部件为转头、主轴、电动机和传动装置、制动器、外壳和机座。
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离心机的转头主要有：角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/吊桶式转头（swinging bucket rotors）
水平转头
角度转头
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离心技术类型
常用离心技术一般包括：
差速离心法（differential velocity centrifugation）
密度梯度离心法(density gradient centrifugation)。
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差速离心法 （differential velocity centrifugation）
采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降系数不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。
常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。
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Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
The preparative ultracentrifuge
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差速离心法 （differential velocity centrifugation）
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密度梯度离心
原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。
等密度梯度离心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介质。
此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
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Density gradient centrifugation
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Density gradient centrifugation
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实验步骤
1．将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉,称取2克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。
2．量取10ml 匀浆buffer，先向研钵中倒入5ml后开始研磨。
3．四层纱布过滤，收集过滤液到10ml离心管中，再将剩下的5ml匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管中，5000rpm离心5分钟, 去上清。
4．加入 % TritonX-100 , 混匀，振荡后静置3分钟. 5000rpm离心5分钟，去上清。
5．加入1ml CSK buffer 振荡混匀,可以用枪头轻轻吹打沉淀使其溶解.
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6．滤膜过滤（300目）, 去掉未裂解的原生质体及裂解的细胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液。
以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒体、叶绿体, 下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿体。
7. buffer 3ml加至于离心管底部.
8. 再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于7的溶液上方, 用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上. 这时应该能观察到溶液明显的分层现象.
9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分层现象。
10. 3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。
、镜检。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的形态特征。
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试剂
匀浆buffer：5mM MES, CaCl2, 11mM KH2P