文档介绍：一、 PCR 技术及步骤聚合酶链式反应( PCR ) PCR 扩增产物的克隆上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、 PCR 常见问题汇总 1. 没有得到扩增产物(1) 酶失活或在反应体系中未加入酶。 Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活, 往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。(2 )模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。(3) 变性温度是否准确: PCR 仪指示温度与实际温度是否相符, 过高酶在前几个循环就迅速失活; 过低则模板变性不彻底。(4 )反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加 Taq 酶以前,将反应体系 95 ℃加热 5-10 分钟。(5 )引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。(6 )使用 PCR 试剂盒时还应注意: ①是否严格按照说明书操作; ②试剂使用前是否充分混匀; ③试剂储存过久或不当而失效。 2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状(1 )酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。(2) dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。(3) MgCl 2 浓度过高。可适当降低其用量。(4 )循环次数过多;增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的 PCR 循环。(5 )退火温度过低。(6 )电泳体系有问题: ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大; ②凝胶没有凝固好; ③琼脂糖质量差。(7 )若为 PCR 试剂盒则可能: ①由于运输储存不当引起试剂盒失效; ②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。(8 )降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 3. 溴酚蓝前有区带(很宽) (1 )模板量太低。增加模板 DNA 的用量。(2 )循环次数太多。减少循环次数。(3 )复性度偏低。提高复性温度。(4 )预变性后没有立刻上机循环。(5 )引物 3' 端是否互补;重新设计合成较长的引物。(6 )引物用量偏多。降低引物的使用量。 4. 扩增产物出现多条带(1 )引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。(2 )循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。(3 )酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。(4) 退火温度偏低, 退火及延伸时间偏长。应提高退火温度, 减少变性与延伸时间, 也可采用二种温度的 PC R 扩增。(5 )样品处理不当。(6) Mg 2+ 浓度偏高,因适当调整 Mg 2+ 使用浓度。(7 )若为 PCR 试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。 5. PCR 假阳性结果(1 )引物设计不当,应调换引物。(2 )循环参数不合适,导致非特异性扩增。(3 )靶序列的交叉污染。 6. PCR 假阴性结果(1 )引物长度不够。(2 )试剂浓度不标准。(3 )靶序列如突变、缺失等。(4 )循环参数设置错误。(5 )标本中有 Taq 酶抑制剂。(6) PCR 产物检测系统灵敏度不够。三、 PCR 经验总结 1. 增加 PCR 的特异性(1 )引物设计这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件: a 足够长, 18-24 bp ,以保证特异性. 当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,