文档介绍:原代细胞培育试验
指导老师:费晓方
2005年5月
驾驭无菌操作技术。
了解小鼠解剖操作技术。
了解原代细胞培育的一般方法与步骤。
了解培育细胞的消化分散。
了解细胞计数方法。
了解倒置显微镜的运用。
试验目的和要求:
试原代细胞培育试验
指导老师:费晓方
2005年5月
驾驭无菌操作技术。
了解小鼠解剖操作技术。
了解原代细胞培育的一般方法与步骤。
了解培育细胞的消化分散。
了解细胞计数方法。
了解倒置显微镜的运用。
试验目的和要求:
试验原理:
原代细胞培育
是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培育使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以视察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的苍老,死亡等生命现象。
试验内容:
动物的选择:
选择大约一半足孕时间的胚胎,10-13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞,成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎1个
试验材料:
每组的超净台中有以下物品:
1. 50ml 配制好的RPMI1640培育液1瓶;8ml小牛血清(FCS) 1瓶;100ml %胰蛋白酶 1瓶;PBS(-)1 瓶
2. 100ml灭菌烧杯2个;
3、50ml离心筒2个
4、灭菌培育皿1个,细胞培育瓶1个
4、1ml ,200μl移液器各1支;枪头盒2个;无菌玻璃搅拌棒1个
5、细胞计数板1块;
6、灭好菌的镊子1把,剪刀1把;
7、酒精灯1台;
试验操作步骤:
1)胚胎的分别。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
a.接受认可的方案处死啮齿动物。
b.马上在无菌超净台内用70%乙醇擦洗整个动物。
c.用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d.用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宫,置于无菌的培育皿上。
e.剔除胚胎四周的包膜,将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。
f.漂洗胚胎,去掉PBS。接着用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
2)将1-2个胚胎转移至一个小的无菌培育皿中,用新的无菌剪刀当心地绞碎胚胎, 用PBS漂洗。
3)在无菌状态下,将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml %的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。
4)在暖和的环境中或置于37 °C培育箱中轻轻摇动15分钟。
5)让存留的组织块在重力作用下渐