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松花菜小抱子发育的细胞学观察
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摘要：以松花菜F1代杂交种为材料，分别观察自然发入5mLddH2O&解，配成1mg/mL的母液，用离心管分装后置于-24C冰箱保存。将完全溶化后的染色液用ddH2O稀释成10卩g/^L的工作液，选取不同大小的花蕾，用镊子小心摘取2〜3枚花药，置于滴有DAPI染液的载破片上，轻轻挤压出花粉，挑出杂质，盖上盖玻片，在避光条件下染色10min,用OlympusCKX5荧光倒置显微镜进行细胞学观察，随机观察5个视野。观察游离培养小孢子发育时期时,取1个培养皿小孢子培养液在1000r/min条件下离心5min,取1滴沉淀于载玻片上，加1滴DAPI染色10min后进行观察，也可直接将培养皿置于倒置显微镜下观察。
小孢子分离与培养选取单核靠边期的花蕾,用75%的乙醇消毒30s，之后用7%勺次***酸钠溶液消毒10〜12min,再用无菌水冲洗3次，每次3〜5min。将花蕾放入无菌小烧杯中，加入适量B5液体培养基,用玻璃棒轻轻挤压,使小孢子游离到溶液中,用350目孔径尼龙筛网过滤，滤液在1000r/min条件下离心3次，每次5min。最后1次离心后将沉淀悬浮于NLN-13(pH=)培养基中，调整小孢子密度为10X104个/mL,分装到60mn无菌培养皿中，每皿加4mL悬浮液（每皿约为4个花蕾），并加入100uL的活性炭（）。在33C热激培养24〜48h后转入25C恒温箱暗培养，培养期间每天观察小孢子发育情况，当肉眼可见胚状体时转入摇床（60r/min）震荡培养,约20d后形成子叶型胚。
2 结果与分析
松花菜小孢子体内发育过程
观察发现,发育初期花粉母细胞经减数分裂形成四分体（图1-A）;然后小孢子从四分体中释放出来,形成体积较小的单核小孢子,此时花粉壁较薄，细胞核位于中央，外形呈梅花形（图1-B）。此后，小孢子逐渐生长,细胞壁开始加厚,内部形成大液泡,细胞核靠近边缘,为单核靠边期；外形为不明显的三棱状（图1-C），此时是进行松花菜小孢子培养的适宜时期。随着花蕾的发育,小孢子形状接近正圆,进入双核早期,具有1大1小2个细胞核。此后生殖核分裂成2个精核,小孢子进入三核期
（图1-D）,较大的为营养核，染色质松散，DAPI染色后亮度较弱；较小的2个为生殖核,染色后亮度较高,体积由圆形变为椭圆,形成熟花粉粒。在整个发育过程中,小孢子的大小、形态以及染色深浅明显不同,这为准确判断小孢子发育时期和精确取样提供了依据。
小孢子发育时期与花蕾大小的关系细胞学观察发现,松花菜小孢子发育时期与花蕾长度大小的关系基本为：〜;〜;〜〜。在松花菜小孢子培养中,处于单核靠边期至双核早期的小孢子才具备胚状体发生能力。
在本研究条件下，〜，在此范围内精确取样更易获得较高的出胚率。但不同品种花蕾略有差异，因此花蕾长度不能作为取样的唯一标准。
经显微观察发