文档介绍：免疫荧光技术
主要内容
技术原理
1
实验流程
2
注意事项
3
常见问题
4
免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合ocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
酶作用后产生荧光的物质
某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-***伞***-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-***伞***，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-***伞***磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基***等。
镧系
镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。
多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）
PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。
碘化丙啶（ propidium iodide，PI）
可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。
细胞爬片免疫荧光实验流程
1. 细胞爬片的制作；
2. 固定（4%的多聚甲醛）；
3. 细胞膜通透（%Triton X-100，20min）；
4. 封闭（6%山羊血清，30min）；
5. 一抗孵育（一抗浓度，湿盒，4℃过夜，PBS漂洗）；
6. 二抗孵育（二抗种属，湿盒，室温1h，避光，PBS漂洗）；
7. 复染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）；
8. 封片（荧光淬灭剂的封片液）；
9. 荧光显微镜下观察采集图像。
1. 细胞的固定
【固定的定义】
将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。
【固定的意义】
1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免抗原失活或弥散。
2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现自溶分解。
3、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。
4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。
5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。
6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。
免疫荧光实验流程中一些注意事项
【固定液的选择】
2、冰冻切片制备：
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

3、血清封闭：
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。
封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。
血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。
4、一抗孵育条件：
在免疫荧光实验中最重要，包括孵育时间和抗体浓度；
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；
孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min；
具体条件还要摸索。
6、复染：
目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位；
一般常用DAPI复染。

7、封片：
为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液；
避免产生气泡。
5、二抗孵育条件：
二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；
而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索