1 / 91
文档名称:

3-2019基因工程原理ds-测序技术.ppt

格式:ppt   大小:7,481KB   页数:91页
下载后只包含 1 个 PPT 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

文档介绍:3-2019基因工程原理ds-测序技术

第三章 测序技术
第一节 DNA测序策略
第二节 传统的DNA序列分析法
第三节 第二代测序技术简介
第四节 第三代测序技术
*

造福人类的HGP
人类基因组计划(Humaanger法、双脱氧法或酶法。
*
一、基本原理
单链DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以单链的DNA为模板,合成出准确的DNA互补链
能够利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物,参入到寡核苷酸链的3’-末端,从而终止DNA链的延长
*
双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。
*
*
P

OH
dNTP
ddNTP


P
OH
OH









P
P
P
P
OH
*
在4组相互独立的测序反应体系中,分别加入四种不同ddNTP,其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例,使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。
产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰***凝胶电泳和放射自显影检测,直接读出新合成DNA链的序列。
*
*
双脱氧链末端终止法测序原理示意图
*
二、测序反应体系的组成
(一)待测模板
1.单链模板DNA
Sanger法经典测序反应--将待测DN***段克隆于M13mp载体中,得到单链的DNA模板,再按Sanger法进行测序。
2.双链模板DNA
将待测的DN***段克隆到质粒载体上,得到含待测DNA克隆片段的双链质粒,经碱变性处理,与寡核苷酸引物序列退火,按Sanger法进行测序;
*
Sanger双脱氧-M13体系
M13--噬菌体载体,可得到单链DNA序列
Sanger双脱氧-pUC体系
pUC-质粒载体,利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法
*
*
*
*
*
二、测序反应体系的组成
(二)引物
“通用”引物:在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板,还是双链DNA模板,都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物;
通用引物长度:一般为15~30个核苷酸。
*
二、测序反应体系的组成
(三)DNA聚合酶
1.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段): Sanger法最早使用的酶,具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性,催化链延伸反应的能力较差,用它进行测序常产生较高的本底和假带;
2.测序酶(sequenase):经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常稳定,很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度,测定较长DNA的首选酶;
3.Taq DNA聚合酶:PCR反应关键酶,在95℃的高温下保持稳定,可在高温下进行反应,该酶用于测序具有很好的链延伸性能,能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。
*
二、测序反应体系的组成
(四)放射性核素标记的dNTP
α-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。
*
二、测序反应体系的组成
(五)测序产物的凝胶电泳及识读
能否将测序反应中产生的各种不同长度的DN***段进行有效分离是序列分析成败的关键。
*
三、Sanger双脱氧链终止法的特点
1.快速简便,一次反应可测500个以上的碱基序列;
2.荧光染料代替放射性核素标记,使该法便于实现自动化分析,能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。
*
Maxam-Gilbert DNA化学修饰法
1977年哈佛大学A.M. Maxam和W. Gilbertf发明
原理:
化学试剂处理末端放射性标记的DN***段,造成碱基的特异性切割产生一组具有不同长度的DNA链混合物经凝胶电泳分离和放射自显影,读出待测DN***段的核苷酸序列
*
由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的,所以切割反应必定是定量的
化学切割反应的试剂:
肼 hydrazine
联氨 NH2-NH2
硫酸二甲酯 dimethylsulphate
六氢吡啶
*
碱性条件下,肼与胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶( C )作用
通过六氢吡啶作用,使两个磷酸分子从糖片段上释放出来,导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂
盐存在的条件下,肼同T的反应被抑制,只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应
由此区别C和C+T两种反应
*
硫酸二甲酯((CH3O)2SO4)
一种碱性的化学试剂
作用于DNA碱基环中的氮原子,使之***化
在中性的pH值环境中,可导致配糖键发生水解,使去碱基的糖-磷酸键十分微弱
碱性条件下磷酸

分享好友

预览全文

3-2019基因工程原理ds-测序技术.ppt

上传人:杨勇飞淘豆2 2022/5/19 文件大小:7.31 MB

下载得到文件列表

3-2019基因工程原理ds-测序技术.ppt

相关文档