文档介绍:3酶工程山东师范大学
第二章 酶与细胞的固定化
固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内,使其保持活性并可反复利用。
,稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影 TEMED
2)微囊型包埋法
(microencapsulation)
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜:直径几十微米到几百微米,厚约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径,小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出,被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比,微囊型包埋法的优点:
1)固定化酶颗粒小,有利于底物和产物扩散。
2)半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入,注入体内既可避免引起免疫过敏反应,也可使酶免遭蛋白水解酶的降解,具有较大的医学价值。
缺点:反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法,与其它固定化方法相比:
优点:不与酶蛋白氨基酸残基反应,很少改变酶的高级结构,酶活回收率高。
缺点:只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
酶的四种固定化方法
固定化方法
吸附法
包埋法
共价结合法
交联法
物理吸附法
离子吸附法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收
高,酶易流失
高
高
低
中等
再生
可能
可能
不能
不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性
不变
不变
不变
可变
可变
各种固定化方法的优缺点比较
分类方式
固定化细胞
分类方式
固定化细胞
细胞类型
微生物
植物
动物
生理状态
死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器
活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
(二)细胞的固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体,借助物理(如加热、冰冻)、化学方法(如柠檬酸、各种絮凝剂)将细胞直接固定。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法
3)包埋法
2. 固定化方法
例如:葡萄糖异构酶(白色链霉菌),是一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟,使菌体自溶作用的酶失活,而葡萄糖异构酶仍然保持活性,长期使用酶活力不减少。
微生物细胞
植物细胞
动物细胞
吸附法
吸附力较弱,细胞易脱落
包埋法
实验:
%左右的卡拉胶 ,70 ℃溶解, 再冷却到 42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃)
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
一般采用网格包埋法(即凝胶包埋法)。常用凝胶:琼脂凝胶,海藻酸钙凝胶,角叉菜胶和光交联树脂。
注意:一般要加渗透压稳定剂,以防止原生质体破裂。
(三)原生质体的固定化方法
第二节  固定化酶和固定化细胞
的性质与表征
一、固定化酶的性质
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
(一)酶的活性 :
通常低于天然酶(有例外)。
(二)酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因:
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度,
可防止酶分子伸展变形;
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
如:氨基酰化酶,
70℃,15分钟,酶失去活性。
而固定化后, 70℃,15分钟,有>80%活性。
(三)酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升,最适温度也上升(有例外)。
(四)酶的最适pH
带负电荷载体 :最适pH 向碱性偏移。
带正电荷载体 :最适pH 向酸性偏移。
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电