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临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班.pptx

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文档介绍:基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用
刘敬忠

首都医科大学附属北京朝阳医院
北京基因诊断实验室
北京朝阳医院法医物证司法鉴定所

第一页,共84页。




第二页,共84页。

中六页,共84页。

如果引物5’端有几个与模板DNA不配对的碱基,仍可能与模板DNA退火、延伸,对PCR效果影响不大。这一特点,可使PCR产物两端带上限制酶的Linker,或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。

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影响PCR效果的重要因素及注意事项:
PCR技术的原理似乎非常简单明了,PCR反应的操作也并不复杂;但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处,并把握其各种影响因素,规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素

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引物设计一定要科学合理,序列的特异性要高。
长度一般在18-25个碱基,Tm值可按公式(G+C总数x4)+(A+T总数x2)(℃)估算。
尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。
尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体(Dimer)的可能性。
G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。
同一反应管中的引物(甚至同一个Lab的所有引物)Tm值设计的相同。

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引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PCR及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。
基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。
各种试剂小量分装保存,避免多次冻融。
dNTP浓度要优化。

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退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败,非特异产物的出现与否关系最大。
Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。
对扩增难度较大的PCR,Mg2+浓度要适当增加。
操作者的手法也有影响,要在实践中总结提高技术。

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荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较


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HLA分型技术
HLA(人类白细胞抗原)
MHC区基因(主要组织相容性复合物基因区)
高度多态性的基因区

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HLA分型技术
一、淋巴细胞微量细胞毒试验
1964年,Paul Terasaki, LA, USA
二、DNA分型法
优点:
1. 血样不要求新鲜;
2. 白血病患者WBC表面抗原被破坏, 只
能用DNA分型法;
3. 结果更准确可靠

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HLA分型技术
DNA-RPLP, 1982
PCR/SSO
PCR/反向斑点杂交
PCR/SSCP
PCR/SSP
PCR/SBT
R-Q-PCR/SSP
PCR/dHPLC等

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在序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术基础上,将荧光定量PCR(FQ-PCR)技术与SSP结合起来,建立了自动化程度更高的荧光定量PCR- HLA分型技术,完成了46例尸肾供受者的HLA-DBR1分型。 FQ-PCR不需走电泳,减少了污染的机会,提高了自动化程度。同时又开展了以DNA测序为基础的HLA分型(SBT)技术。

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三、主要方法:
1、HLA血清学分型。
2、常规PCR-SSP反应。
3、SBT分型法: (1)PCR扩增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自动测序仪测序。 (3)测序数据分析及分型。

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结果和讨论
一、进行PCR-SSP法HLA-DRB1位点分型:

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第二十九页,共84页。

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4、荧光定量PCR技术原理:

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图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比

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图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果

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图5、SSP分型结果与上述一致

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FQ-PCR分型的优点:
(1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作,简化步骤,提高自动化程度,减少了工作量。
(2)判读结果与扩增由仪器同时完成,节省了PCR后处理的时间,结果更客观。
(3)将引物的特异性和探针的特异性结合,提高了准确性。

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(4)只需在反应前打开离心管一次,即可

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