文档介绍:MTT法检测细胞活力讲解
第一页,共23页。
MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况
用于评价药物产生的细胞毒作用
2020/11/30
2
第二页,共23页。
原理
四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,001umol/l,稀释倍数为10,,、 、、、,。代入 计算公式:Pm=Pn=P=+++++=Xm==-1lgI==1lgIC50=-1-1*(-(3--)/4)=-IC50=
2020/11/30
12
第十二页,共23页。
注意事项
1. 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2.  设空白对照,与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。
2020/11/30
13
第十三页,共23页。
实验前应明确的问题
。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2020/11/30
14
第十四页,共23页。
。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
2020/11/30
15
第十五页,共23页。
。100ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
 
,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
2020/11/30
16
第十六页,共23页。
,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二***亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二***亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
 
。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
2020/11/30
17
第十七页,共23页。
关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定。 悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。
2020/11/30
18
第十八页,共23页。
MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。
注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
2020/11/30
19
第十九页,共23页。
如何清除上清
直接吸出:加DMSO前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-16