文档介绍：背 景
据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细胞可以产生 10,000 种。
在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在于一个蛋白复合体中。
蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地称之为通过节点品名, 本身是agarose做的凝胶。
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转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min)；
孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
加入35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ；
1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，加入40μl 2×SDS Sample Buffer（125mM Tris•Cl , 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, %溴酚蓝）沸水浴中煮沸5min；
Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。
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抗体的选择：
1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能结合未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
3. 抗体用量的控制：1-4μg（通常用2 μg ）
4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
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优 点
相互作用的蛋白都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
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缺 点
可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果（但如果结合质谱检测就可以分析所有的结合蛋白的种类）。
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通过质谱确定捕获的蛋白
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结果分析
盐离子浓度影响coIP结果 很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受以上的高盐而不解体。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。在生理盐或更低盐浓度下进行coIP可能增加假阳性几率—很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。通常选择做细胞裂解。。
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2. 过表达 血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，也可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用。
3. 不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗 NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。
-%。
-%时，染色体很容易析出，造成样品过粘而需要超声。
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4. 超声和冻融的影响
很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。
但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用。
5. Tag的影响
His-tagged主要用于纯化蛋白。用His-tagged蛋白进行coIP存在潜在的隐患。因为很多蛋白会有富含histidine的domain，遇到效价非常好的抗体会使很多内源性的蛋白都被该抗体识别。造成coIP的假象。
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