文档介绍：肿瘤坏死因子
作者：孙嗣国，马保安，周勇，范清宇
【关键词】，肿瘤坏死因子
Osteoclast formation and bone resorption induced by tumor necrosis factora
[Ab cells, PBMCs)及 ，并加入TNFa及其他因子，验证TNFa 是否可以直接诱导破骨细胞前体细胞分化为具有骨吸收活性的破骨 细胞.
1材料和方法
u/mL青霉素，10 mg/L链 霉素和1。mmol L谷氨酸及100 mL/L胎牛血清(Invitrogen, UK) 配制成完全培养基(MEM/FBS);重组人巨噬细胞克隆刺激因子 (MCSF)、鼠可溶性细胞核因子kB受体活化因子配体(solvable receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, sRANKL)、 RANKL 拮抗剂(RANK:Fc), TNFa, ILla,抗 TNFa 中和抗体均 购于R&D Systems公司(UK),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)
试剂盒购于Sigma公司(UK).
~9 wk的BALB/c小鼠(第四军医大学 实验动物中心提供). Rogers博士 (Aberdeen, UK)惠赠.
厚,再冲压成直径4
mm的圆形骨片，超声波处理，消毒备用.
、培养及试验分组将小白鼠外周 血按1 : 4稀释于MEM后缓慢加到histopaque (Sigma, UK)表面, 离心(693 g) 30 ，重悬于MEM并离心 (600 g) 10 min,重复两次，然后重悬于MEM/FCS. 50 mL/L 醋酸溶解红细胞后， mm 直径的象牙磨片和直径6 mm的玻璃盖玻片分别放入96孔细胞培养 PBMCs加入放有象牙磨片或盖玻片的96孔细胞培 养板，调整培养液(MEM/FBS)至总体积。.1 mL;孵育2 h后将象 牙磨片及玻璃盖玻片取出，并在MEM/FCS中充分涮洗以去除非黏 附细胞，然后转移到24孔组织培养板，培养板内加入各种因子并调 整培养基至总体积为1 .
实验分组：A组加入25 Mg/L MCSF和10瞄/L ILla作为阴性 对照；B组加入25 Mg/L MCSF和30瞄/L sRANKL作为阳性对 照；C组加入25瞄/L MCSF, 10pg/LILla和不同浓度的TNFa; D 组 E 组加入 25 jiig/L MCSF, 10 jiig/LILla 和 25 jiig/L TNFa, 分别再加入100 Mg/L的抗TNFa中和抗体和RANK:Fc.
mL MEM/FCS及2块玻璃盖玻片或 3块象牙磨片的24孔细胞培养板中，调整培养液至总体积为1 mL. 孵育2 h后将盖玻片和象牙磨片取出并在MEM/FCS中充分涮洗， 去除非黏附细胞后放入新的24孔细胞培养板，培养板内加入各种因 子并调整培养基至总体积为1 mL, 验分组：A组加入25 Mg/L TNFa和1。瞄/L ILla; B组加入10 瞄/L ILla作为阴性对照；C组加入30 Mg/L sRANKL作为阳性对 照.
h中止部分象牙磨片和玻璃 盖玻片上的细胞培养并鉴定，以排除PBMCs中含有成熟OC的可能. 再于9 d, 14 d分别终止玻璃盖玻片和象牙磨片上的PBMCs细胞 ，象牙磨片用于 检测骨吸收陷窝的形成.
TRAP染色：玻璃盖玻片于空气中晾干并用柠檬酸/丙酮固定 细胞，按照试剂盒说明书作组织化学染色检测破骨细胞标志物trap 的表达.
甲苯胺蓝染色及电镜扫描(SEM)：象牙磨片浸泡于NH4OH(1 mol/L) 30 min＞超声波处理去除黏附的细胞及碎片后，蒸偕水润洗 ，光学显微镜下检测虫蚀样骨吸收 陷窝的形成，并计算虫蚀样骨吸收陷窝面积占象牙磨片总体面积的百 、空气晾干并覆以金粉 涂层后做电镜(Philips SEM 505)扫描.
统计学处理：每次实验中各