文档介绍：实验二 GAPDH 基因的 RT-PCR GAPDH 或 G3PDH 是甘油醛-3- 磷酸脱氢酶 GAPDH ( glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase )的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶,由 4个 30 - 40kDa 的亚基组成, 分子量 146kDa 。该酶基因为看家( house keeping )基因,几乎在所有组织中都高水平表达,在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的,且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定,故被广泛用作抽提 total RNA , poly(A )+ RNA , Western blot 等实验操作的标准化的内参 GAPDH 结构图转染了 GAPDH 转染了 GAPDH siRNA 的 Hela 细胞转染了 GAPDH 相关 siRNA 的 HeLa 细胞在转染后 48 小时后不断增殖。红:被标记的 siRNA ;蓝:被染色的细胞核;绿色: GAPDH 蛋白; 阴性对照( scrambled siRNA ) 的导入(左)对 GAPDH 蛋白的表达没有影响,不过若转入一个以 GAPDH (右)为靶标的 siRNA ,则会导致 GAPDH 蛋白表达水平的急剧下降。 GAPDH 的 DNA 序列? ORIGIN ? 1 atggtgaagg tcggtgtgaa cggatttggc cgtattgggc gcctggtcac ? 61 atttgcagtg gcaaagtgga tcaactac ? 121 atggtctaca agta act cacggcaaat tcaacggcac ? 181 gagaatggga agcttgtcat a agga ? 241 actaacatca aatggggtga ggtgct gagtatgtcg tggagtctac tggtgtcttc ? 301 atgg gg acttg aaaagggt ? 361 catgtttgtg atgggtgtga accacgagaa atatgacaac ? 421 tcactcaaga ttgtcagcaa tgc aact aag ? 481 atg acaactttgg cattgtggaa a atcact ? 541 gcc caga agactgtgga tct ggaaagctgt gtggggct ? 601 agaaca tgc actggt aagg ctgtgggcaa a ? 661 gagctgaacg ggaagctcac gtgttc aa tgtg tc cgtc ? 721 gtggatctga t t gccaagtatg atgacatcaa gaaggtggtg ? 781 aagcaggcat actgaagggc atcttgggct aggttgtc ? 841 tcctgcgact tcaacagcaa actct ttcg ggggc tggcattgct ? 901 ctcaatgaca actttgtcaa tggtatgaca atgaatacgg ctacagcaac ? 961 agggtggtgg acctcatggc tccaaggagt aa ?( 1002bp ) RT-PCR 简介? RT-PCR 是将 RNA 的反转录( reverse transcription ) 和 cDNA 的聚合酶链式扩增( PCR )相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA ,再以 cDNA 为模板, 扩增合成目的片段。? RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。作为模板的 RNA 可以是总 RNA 、 mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA ,关键是确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。?用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、 Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞 mRNA ,三种都可。 A…A 5` 3`A…A 5` 3`T…T5`A…A 5` 3`T…T5` 3` mRNA mRNA mRNA cDNA T…T5` 3` 单链 cDNA T…T5` 3` cDNA 5`T…T5` 5`5`