文档介绍：RNA 提取方法及原理 John 1、研究背景 RNA 研究的重要性 DNA , RNA 和蛋白质是三种重要的生物大分子,是生命现象的分子基础。 DNA 的遗传信息决定生命的主要性状,而 mRNA 在信息传递中起很重要的作用。其它两大类 RNA , rRNA 和 tRNA ,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此 mRNA 、 rRNA 、 tRNA 在遗传信息由 DNA 传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 RNA 分布不同丰度组织名称样品量总 RNA 含量高丰度肝脏 1mg 2-4 μg 脾脏 1mg 心脏 1mg 中丰度大脑 1mg -2 μg 胚胎 1mg 肾脏 1mg 肺 1mg 低丰度膀胱 1mg 0- μg 骨 1mg 脂肪 1mg 高丰度成纤细胞 10 5 -1 μg 人白细胞 10 5 中丰度酵母 10 5 - μg 拟南芥叶片 1mg - μg 低丰度烟草叶片 1mg - μg 玉米叶片 1mg 2、方法及原理 RNA 的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA 的纯化及获得 RNA 提取流程-- 样品前处理注意点选择新鲜血液,不得超过 4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织,生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解,得到的白细胞然后加入一定量的 TRNzol ,-70 ℃保存较长时间去掉培养基,加入一定量 TRNzol -70 ℃保存较长时间推荐使用专门的 RNA 样品储存液进行储存液氮或加入 RNase 抑制剂中保存, 避免反复冻融 RNA 提取流程-- 样品前处理中如何保存样本 RNA 提取流程-- 细胞裂解,以释放 RNA 独特配方-- RNAplant 植物 RNA 提取试剂胍盐/β-巯基乙醇— RNAprep 系列 RNA 提取试剂盒异硫***酸胍/酚- TRNzol 总 RNA 提取试剂 RNA 提取流程-- RNA 的纯化及获得 RNA 纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除 DNA 分子的污染 RNA 提取的注意事项 杜绝外源酶的污染一:严格戴好口罩,手套。二:实验所涉及的离心管, Tip 头,移液器杆, 电泳槽,实验台面等要彻底处理。三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free 。 阻止内源酶的活性一:选择合适的匀浆方法。二:选择合适的裂解液。三:控制好样品的起始量。