文档介绍：微生物实验报告
一、实验目的
我们在分子实验中将目的基因（）转化进入大肠杆菌BL21，通过凝胶电泳检测，筛选出了能够表达目的基因的阳性菌落。本部分微生物实验则培养这一阳性菌落中挑出的细菌，使其快速繁殖从而产生大量细菌，并用
种子液的准备
预培养
取平板上单菌落接种于50mL Km/LB培养基中（装在250mL的三角形），37℃，200rpm/min培养8小时。
2．2 二级种子液的准备(200mL)
按1%的接种量接入装有100ml Km/LB的250ml培养瓶中，37℃，200rpm/min培养12hrs后接入发酵罐，接种浓度为200ml/4L。
发酵罐的准备
清洗发酵罐
拆卸并清洗发酵罐的各个部分，随后组装发酵罐。
打开发酵罐系统的动力开关，选择“fermentation”,“screen”调至“calibration”，“enter”确认。
用“”调至“zero”。
, 。
用“”键调到“span”档。
, 。
重复校正2次，。
安装发酵罐，创造密封环境
在灭菌前，要对发酵罐进行部分安装以便创造整体的无菌环境。
具体安装部分是：进气孔橡胶管，出气孔冷凝器，冷凝管进出水孔，pH电极，取样设备，补碱孔橡胶管。其中补料孔一共有3孔，因此要用橡胶管把除补碱孔之外的其余两孔短接，以创造封闭环境。对于所有与外界连通的橡胶管，都要用滤膜封口，以免灭菌过程中有细菌进入罐体。在灭菌前，要在发酵罐中发酵原液再灭菌。同时要注意封闭直接与发酵罐原液连通的硅胶管，以免高温灭菌时液体溢出。
将配制好的培养基、试剂及处理好的发酵罐一起放入高压灭菌锅中， 115℃高温灭菌30min。
8月25日
重组大肠杆菌的高密度发酵与目标产物的大量表达
1、发酵罐的预处理
接上pH电极的插头, 接通底部冷却水管和空气出口处的冷凝器上的冷却水管, 将各硅***管置于相应的蠕动泵上。
把搅拌马达置于搅抖联动装置上。
2、校正DO电极的满刻度
利用光标将搅拌速度调至800r/min，(1vvm)。调到calibration界面，光标调至DO处，“span”档，设定读数为100，反复调节几次，直至稳定至100，转至menu界面（同时校正零点）。
3、再次校正PH电极
虽然灭菌前已经校正过pH，但高温灭菌时会有漂移，因此在发酵开始前要再次校正。在发酵罐中取出一点样，用pH计测出其pH值，pH电极设定界面重新设定PH值。
4、其他参数设定
把光标调到Agit档，设定最小值为200r/min。
把光标调到DO档,设定参数为30, 调整为与溶氧偶联检测。
把光标调到Agit档，设定最大值为800r/min。
把光标调到pH档,，调整为自动检测。
把光标调到“Temperature”档, 设定温度为37℃。
接上碱瓶，打开自动检测系统。
5、离心管的称量
准备若干支5ml离心管，标号并准确称重，用于盛装各次取样的菌液及上清液。
发酵罐的接种培养
加料
1）将蘸满乙醇的棉花球缠在接种口外套上，点燃火焰以前将接种口的盖子旋松。
2）点燃棉花球，取掉盖子，立即通过火焰向发酵罐中加入1瓶葡萄糖溶液、1瓶K2HPO4溶液、1管抗生素4ml、2瓶过夜培养的LB培养液及少量消泡剂。
3）将盖子内口置于火焰内，接种后，用摄子将盖子准确放回原位，旋紧。
4）打开记录实验过程的专用软件。
取样
发酵过程中，每隔1小时取样5ml*2放入事先称好重量的两支离心管内，待测细胞干重和发酵液糖含量变化。
测定OD600（取样品瓶中剩余液，测前吹打均匀）
用糖试纸粗测糖含量，葡萄糖浓度降至5g/L或最高转速下降时，补加葡萄糖。补糖后立即取样，仅保存上清，待测糖含量。
当OD600在8-10之间时，加IPTG1管（4ml，1000X），之后每罐每2小时取100ml，4℃保存。
气泡多时（超过发酵罐空气体积的一半），加入少量消泡剂。
约8h后，发酵结束。
*注：分光光度计测量吸光度值时，有时需要稀释，-，否则结果不准确。
8月26日
发酵动力学曲线测定及分析
1、标准曲线
配置10g/L葡萄糖标准溶液100ml。
配置葡萄