文档介绍：双向凝胶电泳技术 two-dimensional gel electrophoresis technology (2DE)
精选课件
定义一：以凝胶为载体的双向电泳。
定义二：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在凝胶介质二维空浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度（Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃冰箱中进行长期保存。
精选课件
IPG胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl （含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡10-15分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原剂DTT的375mmol/L Tris-HCl ，其他组分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
精选课件
SDS-PAGE
第二向SDS-PAGE有垂直和水平两种方式。垂直方式的特点是可以同时走多张胶，且可以是较厚的凝胶，有利于提高上样量，电泳后可有足够的蛋白量进行进一步分析。缺点是需要大量的缓冲液，电泳时间长，分辨率低，不便于保存，凝胶大小、厚度可任选，可用半干技术。由于有支持膜，更便于长期保存，平衡后的IPG胶可以被水平或垂直放在SDS-PAGE胶上，%低熔点琼脂糖封胶，固定IPG胶，以防电泳时滑动或漂移。
精选课件
染色
常用蛋白质点的染色方法有考马斯亮兰、银染、荧光染料等，其中银染法灵敏度高，可以在电泳图中找到含量较低的蛋白，所需的上样量较少（），可以检测到小于1ng的蛋白点，但线性范围小于2个最高数量级。所有银染方法都是温度依赖的，而且需要精确控时的 操作，决定何时终止染色全凭个人的经验，因此，银染是3种染色法中重现性最差的。考马斯亮兰是3种染色法中灵敏度最低的，检测限度约为每点10ng蛋白，但可以染色多种蛋白质，并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。用考马斯亮兰染色的蛋白点成蓝色，可以用可见光扫描仪捕获胶图。荧光染色法是一种终点染色方法，可以检测到大约1ng的蛋白点，荧光染色法与蛋白量呈3个最高数量级的线性关系，需用荧光扫描仪显示用荧光染色法染色的蛋白点。
精选课件
分离蛋白质的检测与匹配分析
目前常用的图像分析软件有PDQUEST(Bio-Rad）、MELANIEⅡ（SIB,GenBio）、Irnagemaster（APB)、Advanced 2-D Software（Phoretix）和I-IT Ivestigator(GSI),图像分析软件能提供综合管理各种分离和分析过程所必须的控制和分析的功能。2-D PAGE分析软件确定并定量双向凝胶上蛋白点，去除背景方式，匹配相关胶图，比较相关胶图上相应蛋白点强度，准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息到数据库。图像分析软件也能指导手工或点自动切割机械手进行胶上蛋白点的切割，以作进一步的分析。
精选课件
样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化学修饰。一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很难溶解，为了促进其溶解，常加入一些增溶剂如变性剂、表面活性剂、还原剂等，变性剂的作用是破坏氢键，使