文档介绍：双向琼脂扩散试验
授课对象：临床医学专业八年制本科
授课教员：汤玉瑜
授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室
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教学重点 琼脂的制备方法
双向琼脂扩散实验的原理
实验目的 掌握双向琼脂扩散所出现的沉淀现象。
影响沉淀反应的主要因素
、抗体反应的浓度、比例
可溶性抗原
相应抗体
+
沉淀线或沉淀环
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分 类
沉
淀
反
应
环状沉淀反应
絮状沉淀反应
琼脂扩散试验
双向扩散
单向扩散
＋
电
泳
技
术
火箭免疫电泳
对流免疫电泳
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Question:
怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便的定性检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等？
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实验原理
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线.
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沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分.
免疫复合物的形成通常经过两步:抗原与抗体的特异性结合;形成肉眼可见的免疫复合物晶格
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双向琼脂扩散试验的应用
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Ag
Ab
A B C D E F
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；
B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ；
C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ；
D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似；
E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ；
F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
检测未知抗原或抗体
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1:待检Ag 2:标准Ag
待检Ag与标准抗原完全吻合
待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应
待检Ag有与Ab相对应的Ag,但与标准Ag不同
待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低
抗原性质分析
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。
该抗体的效价。
。
抗体效价滴定
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“1” 为单一抗原抗体系统。
“n” 为多个抗原抗体系统。
*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。
抗原抗体纯度鉴定
*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
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单向免疫扩散
将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。
是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。
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绘制标准曲线
标准品抗原浓度测定
不同病人抗原浓度测定
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影响因素
：与扩散速度、沉淀环反相关
：与沉淀环反相关
：兔抗血清优于马、羊
：抗体浓度大沉淀环小
：抗原含量高，扩散时间长
：4～37℃内温度与扩散速度正相关
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实验材料
1．人血清.
2. 兔抗人 IgG 。
3．琼脂糖凝胶板，1%生理盐水。
4．其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。
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实验方法
1．琼脂板的制备 将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融化的1%琼脂糖均匀浇在载玻片上，注意勿产生气泡。
2. 打孔：待琼脂糖凝固后，将琼脂板至于图样上，用3mm打孔器打孔，孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如图所示。
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3．加样：于中央孔加入兔抗人 IgG，周围 1-4 孔加入倍比稀释不同浓度的人血清， 5孔加入生理盐水作对照。每孔各加15μl。 4．将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
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实验结果判定
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至4 孔（1:5、1:10、1:20、1:40 的人抗兔IgG）与中央孔(人血清)之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。5孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。
免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
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结