文档介绍：1
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、实验目的
了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理
将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相1
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、实验目的
了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理
将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，
通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从
而达到测定抗原或抗体的目的。
4
,底糊缸化4
4
4
常用酶及底物
常用酶
底物
加终止液前颜色
加终止液后颜色
辣根过氧化物酶（HRP）
邻苯二***（OPD）
橙黄色
棕黄色
RZ〉
四***联苯***（TMB）
蓝色
黄色
碱性磷酸酶（AP）
对硝基苯磷酸酯（p-NPP）
黄色
黄色
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型：
4
1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）
双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量=抗原量。
3、竞争ELISA
竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
三、主要仪器及试材
以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。
使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含:
1、包被抗原的微孔板；2、阴、阳性对照血清；3、抗猪IgG-HRP结合物；
4、洗涤液；5、底物A液、B液；6、终止液；7、样品稀释液
本实验所需仪器和试剂：
1、酶联免疫测定仪
2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）
3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清
4、酶标抗体（E-Ab）:兔抗猪IgG-HRP
5、包被液（）：,，加
33
ddHO至lOOOmL
2
6、洗涤液（