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实验八、培养基配制与灭菌
目 的 要 求
了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
熟悉分离、培养微生 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 30min
思考题
固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？
配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？
采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。
实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。
消毒和灭菌
三、操作步骤
(—)高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。
1．加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。
2．装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。
3．加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；
4．排气 加热．待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。
5．升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。
6．保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃，20min灭菌。
7．降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。
8．无菌检查 将已灭菌培养基于37℃培养24h，无杂菌生长，即可待用。
(二)干热灭菌法
干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；
1． 装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。
2．升温 关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160～170℃)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。
3．恒温 当温度升到所需温度后，维持此温度2h。
4．降温 切断电源，自然降温。
待电烘箱内温度降到70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。
(三)过滤除菌法
有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因而要采用过滤除菌法。
1．过滤器的种类
(1)滤膜过滤器：由醋酸纤维素、***纤维素等制成，有孔径大小不同的多种规格(、0. 22μm、、0. 45μm等)，。其优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，滤速快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。
(2)蔡氏滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大。每张纤维板只能使用1次。
(3)玻璃滤器：是一种由玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器规格很多，5号(孔径2—5μm)和6号(孔径小于2μm)适用于过滤细菌。其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。清洗方法是：用水充分冲洗，然后浸于