文档介绍：ICS 65. 020. 01816
DB36
江西省地方标准
DB 36/ XXXXX—XXXX
柑橘裂皮病和柑橘碎叶病的RT-PCR检测方
法
Detection of Citrus exocortis viru理或购买无DNA/RNA酶的实验器具。
——PCR扩增仪。
高速台式离心机。
——生物安全柜或超净工作台。
——冰箱（冷藏室4°C和冷冻室-20°C） o
涡旋混匀仪。
制冰机。
——微量可调移液器。
——核酸电泳仪（配电泳槽）。
凝胶成像系统
超纯水仪。
高压灭菌锅。
——手持式植物组织研磨器。
微量核酸测定仪。
离心管（0. 5mL, 1. 5mL, 2. OmL）
——PCR反应管。
——枪头（lOOO^L, 200（iL, 10（iL）

除非另有说明，本标准所用试剂均为生物试剂（BR）。
——焦碳酸二乙酯（DEPC） o
——RNA抽提试剂（TriZol）。
氯仿-异戊醇（24： 1） o
——异丙醇，分析纯试剂。
——无水乙醇，分析纯试剂。
——四甲基乙二胺二钠盐（EDTA-Na2），分析纯试剂。
——三羟甲基氨基甲烷（Tris） , （GR） o
——浓盐酸（HC1）,分析纯试剂。
——冰醋酸，分析纯试剂。
——蔗糖，分析纯试剂。
——漠酚蓝，分析纯试剂。
——氢氧化钠，分析纯试剂。
二甲苯青FFo
——随机引物6N。
——RT 缓冲液[5xPCR buffer] 0
——dNTP [2. 5mM]:脱氧核糖三磷酸腺昔混合物。
——逆转录酶（M-MLV） [200U/nL]。
——酶抑制剂（RRI） [40U/gL] o
DNA 聚合酶混合物（Premix Taq） [DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture 的 2 倍浓度的混合物，500gL] „
lOObp 梯度 DNA 标准分子量（Marker） : lOObp DNA ladder0
——电泳缓冲液（50xTAE） o
琼脂糖。
——漠化乙锭（EB）。
样品缓冲液：6xLoading Buffer0
——PCR 缓冲液[lOxPCR buffer] 0
——Taq 酶[5 U/（jL] 0
8样品采集
1取（制）样物品
枝剪、剪刀、打孔器等工具类，使用前后应121±2°C高压灭菌20min；样品袋、刀片、手套等耗材
类应一次性使用，避免样品间相互污染。

显症或疑似症状（参见附录A）的植株：
种苗采集苗木中部枝条1支，每支枝条至少带3片叶片。
成年树采集树干中部枝条1支，每支枝条至少带3片叶片。

种苗每3个枝条为1个样品；成年树每5个枝条为1个样品。新鲜样品装入可密封塑料袋中，编号并密封保存，及时寄送实验室检验。
8. 3样品的保存
采集的样品在2°C~8°C条件下保存应不超过1周，若需长期保存，应置于-70°C以下。检测后剩余的样品4©条件下保存7天。
9样品RNA制备
实验室样品应充分均一再制备为测试样品。
根据样品材料的特性选择合适的RAN提取纯化方法，样品RNA制备过程在实验室样品制备区进行，避免交叉污染。所制备的RNA样本在4 °C条件下保存应不超过7天，在-2（TC冻存不超过30天，避免反复冻融。
1采用TriZol法制备样品RNA,参考操作步骤：
1）工作台和操作者双手应消毒灭菌。戴手套，用刀片在纸上切取样品较嫩的组织，取其中约 lOOmg组织碎屑作为测试样品，装入1. 5mL离心管，迅速转移到液氮中。
2）将装有测试样品的离心管置于液氮中，用植物组织研磨器将样品制成粉末状，盖好离心管盖置于冰上。根据测试样品量加入400皿~1000叫的TriZol试剂，振荡器上剧烈震荡15s, 室温下静置lOmino
3）将上述样品4°C下12900rpm离心5min后放置于冰上。吸取上清液，转移到新的1. 5mL离心管内。加入所用TriZol试剂1/5体积氯仿-异戊醇溶液，振荡器上剧烈震荡10s后放置于冰上10mino
4）将上述样品4°CT 12900rpm离心lOmin后放置于冰上。吸取上清液，约为所用TriZol试剂1/2体积，转移到新的1. 5mL离心管内。加入4°C预冷的异丙醇溶液，约为所用TriZol 试剂1/2体积，上下轻柔颠倒离心管，-20°CT静置2小时。
5）将上述样品4°C下12900rpm离心lOmin后，弃除上清液，冰上加入4°C预冷的75%乙醇溶液ImL,上下颠倒离心管洗涤沉淀，4°C下7000rpm离心Imin收集半透