文档介绍：质粒三种提取方法的比较
基因工程原理与技术实验部分：
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质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ： mol/L NaOH (临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ， H2O ，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
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9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。 eppendorf管分装成小份保存于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂), Tris·Cl () Tris·Cl(),因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 11、 ***仿:按***仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。***仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与***仿即得酚/***仿(1:1)。酚和***仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl ()，1 mmol/L EDTA ()。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 13、STET： mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl()，10 mmol/L EDTA ()， 5% Triton X-100。 14、STE： NaCl，10mmol/L Tris·Cl()，1mmol/L EDTA ()。 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，，并加入 EDTA () 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)：% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
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操 作 步 骤
一、 细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
二、 质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
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（一）、煮沸法
，于8 000r/min离心1min，弃上清液。
将沉淀回溶于350μL STET ( mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl()，10 mmol/L EDTA ()， 5% Triton X-100。)中。
加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10 000r/min离心10min。
吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入 （）和420μL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。
12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。
用20μL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存
试验步骤：
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（二）、碱裂解法
1、 eppendorf管中,4℃下10000rpm离心5min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于150μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ300μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入227μl预冷的溶液