文档介绍：实验一 细菌质粒DNA的提取和纯化
一、实验目的
通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。
二、实验原理
细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。
质粒DNA的提取方法有三种：碱
实验一 细菌质粒DNA的提取和纯化
一、实验目的
通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。
二、实验原理
细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。
质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。
碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。
三、实验菌株
含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E. coli.）
四、实验用具和药品
实验用具
摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（）。
LB培养基配方：
ddH2O
950mL
细菌培养用胰化蛋白胨
（bacto-tryptone）
10g
细菌培养用酵母提取物
（bacto-yeast extract）
5g
NaCl
10g
琼脂粉
（配制固体培养基时需加入）
15g
（5mol/L ），高压灭菌
固体平板上添加氨苄青霉素
（二）菌体收集
实验当天 ：
，5000r/min离心2min；
弃上清
（三）碱裂解法提取质粒DNA
全套操作约需1小时，详细说明如下。
3. 加入250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。
注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
注）此步骤不宜超过5分钟。
5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。
注）此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube 上。
8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
9. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率
14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
六、实验作业
按上述实验步骤提取质粒DNA。
思考本实验的关键步骤是什么？
答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。
实验二 大肠杆菌的遗传转化
一、实验目的
通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。
二、实验原理
转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。
目前应该较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。
CaCl2转化法的原理是在低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物。
三、实验材料
质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因
大肠杆菌（）DH5α菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）
四、实验用品
超净工作台、摇床
水浴锅、离心机
分光光度计、移