文档介绍：第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量, GC-MS 一级谱图可以定性分析, LC-MS 能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标物的部分碎片,可以对目标物的结构进行分析。在蛋白测序方面,一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint , PMF) 可以初步推测蛋白质的种类、序列。 PMF 基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到 PVDF 膜上并切下,经过原位酶解得到酶解肽段,然后用质谱得到这些肽段的 PMF ,即获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同, 当蛋白质被酶解后, 产生的肽片段序列也不同, 其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库, 结合适当的计算机算法, 可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序, 必须依靠大量的数据库信息进行比对,准确率也受到限制。串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列, 其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子, 进入二级质谱, 经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂, 由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析,也可以进行手工解析。在第一级质谱得到肽的分子离子, 选取目标肽的离子作为母离子,与惰性气体碰撞,使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式,产生 6 中不同的碎裂离子:即 N端的 a, b,c 型离子与 C 端的 x, y,z 型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子,如 a-x,b-y,c-z 。最常见的是 a 型离子、b 型离子和 y 型离子, 其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析, 可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点, 还能用于翻译后修饰的分析(糖基化、磷酰化),但目前只适用于 20 个氨基酸以下的肽段。此外,还存在固有的局限性, 比如 Leu 和 Ile、 Lys 和 Gln 不能区分, 有些肽的固有序列不能用质谱法测定。第三代测序测序技术在近几年中又有新的里程碑。以 PacBio 公司的 SMRT 和 Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术, 被称之为第三代测序技术。与前两代相比, 他们最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行 PCR 扩增。 SMRT ( single molecule Real-Time )测序技术该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想,并以 SMRT 芯片为测序载体。基本原理是: DNA 聚合酶和模板结合,4 色荧光标记的 4 种碱基( 即是 dNTP ), 在碱基配对阶段, 不同碱基的加入, 会发出不同光, 根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW) 的纳米结构中完成。这种 ZMW 是直径 50-100 纳米,深度 100nm 的孔状纳米光电结构,通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列, 光线进入 ZMW 后会呈指数级衰减, 从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。Φ 29 DNA 聚合酶被固定在 ZMW 的底部, 模板和引物结合之后被加到酶上, 再加入四色荧光标记的 dNTP (A555-dATP, A568-dT