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蛋白质分子量测定方法研究进展.ppt

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蛋白质分子量测定方法研究进展.ppt

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文档介绍

文档介绍:目录
其他方法
第一页,共二十二页。
SDS-PAGE凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是实验室进行蛋白质研究中最常用的技术,兼有电泳和分子筛的双重作用。
SDS是一种阴离子去污剂,可使蛋白质变性,与其蛋白质结合成带负电荷与分子量对数成线性关系。在实际操作过程中,选取标准品与样品同时通过凝胶柱,通过已知标准品的流出体积和分子量可以计算出曲线中的K1、K2值,再根据已知的曲线方程和样品流出体积计算样品的分子量。
第九页,共二十二页。
凝胶渗透层析法
优点:操作简单,设备简单,样品用量少,周期简单,条件温和,一般不引起生物活性的改变。
缺点:应用具有一定的局限性,在pH6—8的范围内,线性关系比较好,但在极端pH时,一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时,测得分子量比真实的要大,铁蛋白则与此相反,测得的分子量比真实的要小。
第十页,共二十二页。
质谱法
1906年,Thomson发明了质谱技术,最初只是用于无机化学中的同位素分析,直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来,生物质谱技术取得了突飞猛进的发展,其中以分别由美国科学家和日本科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)的贡献最为突出。
可准确测定分子量
第十一页,共二十二页。
(ESI-MS)
原理:电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷密度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群,通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量,由于ESI-MS可以产生多电荷峰,因此使得测试的分子质量范围大大扩大。
第十二页,共二十二页。
(ESI-MS)
电喷雾是一种离子化方法,可以用作质谱仪的离子源
第十三页,共二十二页。
(ESI-MS)
多电荷使得样品谱图复杂
荷质比:
第十四页,共二十二页。
(ESI-MS)
优点:
(1)对样品的消耗少,不会造成样品的大量浪费;
(2)对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高;
(3)能够方便地与多种分离技术联用,如毛细管电泳、高效液相色谱等,是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。
缺点:
对样品纯度要求高,且会形成多电荷的质谱峰群,难以分辨,使得结果分析较为困难。
第十五页,共二十二页。
(MALDI-MS)
原理:基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)是将待测物悬浮或溶解在一个基体中,基体与待测物形成混晶,当基体吸收激光的能量后,均匀传递给待测物,使待测物瞬间气化并离子化。
将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪(TOF)直接联用,即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比,检测离子。
第十六页,共二十二页。
(MALDI-MS)
优点:(1)同ESI-MS 一样对样品的消耗很少;
(2)MALDI-MS 的最高分辨率不断提高,甚至超过ESI-MS;
(3)有利于对复杂混合物的分析,且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分,降低了对样品预处理的要求;
(4)MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广。
缺点:在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时,目前只能采取离线的方式,致使分析结果的重复性较差,与MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。
第十七页,共二十二页。
其他方法
除了以上几种目前实验室常用的测定方法,还有一些现在在实验室一般不太使用的方法,包括粘度法,渗透压法,辐射失活法,超速离心沉降法,光散射法等。
第十八页,共二十二页。

粘度法是指通过测定样品溶液的粘度,从而计算样品的的分子量的方法。一定温度条件下,高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性,随着分子量的增大,聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化,即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子的分子量愈大,则它与溶剂间的接触表面也愈大,摩擦就大,表现出的特性粘度也大。
特性粘度[η]与相对分子量M之间遵循Mark-

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