文档介绍：: .
西南农业学报 苏 宇 1，于海英 2，赵冰峰 1，蒋 欢 1，唐贵婷 1，张 勇 1，
吴朝君 1，王旭祎 1
（1. 重庆市渝东南农业科学院，重庆涪陵 408000；2. 国家林业和草原局森林和草原病虫
害防治总站，辽宁沈阳 110034）
摘 要：【目的】建立松材线虫微滴式数字 PCR 检测体系，验证该检测体系的有效性，为松材线虫检测提
供一个更精确灵敏的定性检测方法。【方法】基于松材线虫 16S rDNA 基因序列，使用在线工具设计特异性
引物和探针。优化 PCR 反应条件，明确微滴式数字 PCR 的最佳反应条件。再以采集自不同地区的 6 株松
材线虫和 12 株拟松材线虫、滑刃线虫、伞滑刃线虫、垫刃线虫的基因组 DNA 溶液为模板对该体系的特异
性进行检测；以稀释 10 倍的标准 DNA 为模板，设置不同浓度梯度来验证该体系的灵敏度；以 3 个不同浓
度的 DNA 标准品稀释模板检测微滴式数字 PCR 的可重复性。最后以人工模拟添加线虫样品和感病松木样
品 DNA 提取液为模板对该体系的实用性进行验证。【结果】1）设计了松材线虫特异性引物探针一组，引
物：P1904-F、P2057-R；探针：Probe-1938。2）PCR 反应体系经优化，确定其最佳退火温度为 55 ℃。3）
特异性验证表明，设计的引物探针可以将松材线虫与其他相近种的线虫区分开。4）灵敏度检测结果发现，
该检测体系的检出浓度在 ～20 000 copies/μL。5）对 3 组不同浓度标准样品的可重复性检测发现，该检
测体系的变异系数在 %～%之间，并且样品浓度与变异系数呈负相关。6）使用该检测体系检测林
间感病松木样品和人工模拟加入松材线虫的样品发现，该检测体系能够特异地检测出样品中的松材线虫，
且拷贝数与样品中的线虫量呈正向相关。【结论】本研究建立了松材线虫微滴式数字 PCR 检测体系，该方
法特异性好，检测灵敏度高，变异系数小，可高效地检测出样品中的松材线虫。该体系的建立可为松材线
虫病理学和生态学研究提供可靠的研究数据。
关键词：微滴式数字 PCR；松材线虫；检测体系；特异性；灵敏度；可重复性
中图分类号： 文献标识码：A