文档介绍：特殊显微镜的使用（3） 荧光显微镜的原理及其应用
一、实验目的：
掌握荧光显微镜的原理和使用方法
二、实验原理
荧光显微镜(fluorescence microscope) 是荧光显微术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发高峰）的激发滤色镜，以便从***灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
激发滤色镜加放于***灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量较多，可按不同需要选用。
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阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光。
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二向色镜（chromatic beam splitter）:荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一重要的分色镜系统——二向色镜位于***灯***激发滤色镜构成的水平光轴与目镜和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45°，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能。在荧光显微术中承当色光的“分流”作用。
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荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品，激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。***灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
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反射荧光显微术的光路:反射荧光又称落射荧光，因激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。其光路如图3-1和3-2所示。
***灯发出高强的激发光，经集光透镜，吸热玻璃，孔径光阑，激发滤色镜，视场光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以上的长波光线透过二向色镜，脱离光路，一定波长以下的短波光线反射向下进入物镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发出可见的荧光，荧光反射向上再次进入物镜，复经二向色镜其中波长较短的光线反射至光源方向，荧光和长波光线透射向上经阻断滤色镜进入目镜。
荧光显微镜的光学原理见图3-3：
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图3-1落射荧光显微镜光路图
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图3-2落射荧光显微镜光路图
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图3-3荧光显微镜的光学原理
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荧光的种类
自发荧光（固有荧光）
二次荧光
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荧光显微镜的类型
1、透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。
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透射式荧光显微镜效果图
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透射式荧光显微镜光路图
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2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强
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荧光显微镜内部构
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落射荧光显微镜光路图
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使用方法
(1)高压***灯的调中：***灯调中检验器似物镜状，使用时将其全部旋入物镜转换器，中部有一圆形屏，能映现***灯的电弧像，用以观察调中