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常规病毒学实验技术
（一）病毒的培养
实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠
主要用于：
分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒
培养病毒，制造抗原和疫苗
测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
乙二***四乙酸二钠（EDTA）
营养液
人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
血清
1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子
2）促进细胞的贴壁和生长。
3）
具有很强的酸碱缓冲作用。
二）病毒感染力的滴定
LD，EID，TCID
（50TCID5050的5测0定）
，从10-1—10-10。
将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种lOOul。
然后在每孔加入细胞悬液lOOul，使细胞量达到3X105个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID的计算方法：
50
-Muench法
病毒液稀释度
出现
CPE孔
不出现CPE孔
累计
出CPE的孔
所占的％
出现CPE孔
不出现CPE孔
10-1
8
0
27
0
100(27/27)
10-2
8
0
19
0
100(19/19)
10-3
7+
1
11
1
(11/12)
10-4
3
5“
4
6
40(4/10)
10-5
1
7
1
13
(1/13)
10-6
0
8
0
21
0(0/21)
高于50%的百分数-50%-50
距离比例二==
高于50%的百分数-低于50%-40
lgTCID=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
50
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=(-1)+(-3)=-
TCID=10-
50
病毒液稀释度
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
出现CPE孔的比率
8/8=1
8/8=1
7/8=
3/8=
1/8=
0/8=0
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lgTCID=L-d（s-）
50
L:最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID=-1-（-1）X（-）
50
=-
TCID=10-
50
三）病毒中和试验
、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。
二、用途
疾病诊断。
病毒分离株的鉴定。
不同病毒株的抗原关系研究。
疫苗免疫原性的评价。
免疫血清的质量评价。
测定实验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类
（一）终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法。
1）将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2）在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。
3）在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37°C5%CO2培养箱中作用45min-60min。
4）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。
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5）感作完成后每孔加入lOOul细胞悬液，放37°C5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法：
累计
血清稀释度
CPE孔数
无CPE孔数
CPE孔数
无CPE孔数
保护率
1:4（10-）
0
4,
0
9
100
1:16（10-）
1
3
1
5
83
1:64（10-）
2T
2
3
2
40
1:256（10-）
4
0
7
0
0
1:1024（10-）
4
0
11
0
0
高于50%的保护率-50%
距离比例=-
高于50%的保护率—低于50%的保护率
83-50
==
83-40
高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例X稀释系数的对数
=+（-