第六章真核基因在大肠杆菌中的表达.ppt

文档介绍：真核基因的大肠杆菌表达体系
大肠杆菌的表达载体
克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素
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大肠杆菌表达体系
克隆基因正确表达的基本条件
克隆基因表达活性的检测
第二页，共蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上

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第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件
第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。
（IPTG）
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乳糖启动子Plac的可控性
野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高
P
O
基地水平转录
阻遏蛋白
乳糖 异丙基β－D硫代半乳糖苷IPTG
诱导
高效转录
P
O
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乳糖启动子Plac的可控性
野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP
结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5
cAMP
CAP
高效转录
Plac
o
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
Plac
o
基底水平转录
PlacUV5
o
高效转录
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启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。
转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。
2. 转录终止子
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强化转录终止的必要性：
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：
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转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率
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目前外源基因表达质粒中常用的终
止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对于一些终止作用较弱的终止子，通常
可以采用二聚体终止子串联的特殊结
构，以增强其转录终止作用
终止子也可以通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选
强终止子的选择与使用
筛选Apr、Tcs的转化子
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外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
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核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；
翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；
SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；
基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
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显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。
5. 转译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。
大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的