文档介绍：一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法
专利名称：一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法
技术领域：
本发明涉及一种新型蛋白酶谱的电泳检测方法，属于生物技术技术领域。
背景技术：
蛋白酶(proteases, proteinases)也称为肽酶( Tris-，, 10%过硫酸***25 μ 1， μ I ;混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入Iml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5%的上层浓缩胶:30%凝胶贮备液 , 的 Tris-，蒸馏水 , 10% 过硫酸*** 20 μ I, μ I ;插入梳子，避免混入气泡，放置室温下；2).将样品与加样缓冲液混匀后加样；3).-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，IOmA稳流分离样品直至溴酚兰指示剂到达胶的最前沿；4).电泳结束后，%Triton X-100将胶洗三次，每次15min ;然后用预冷的
蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100 ；5).将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为1%底物的溶液中，37° C温浴2h后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净，% (w/v)的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为:lg考马斯亮蓝R-250, 350ml乙醇，IOOml乙酸,加水至IOOOml ;脱色液配方为:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至1000ml。本发明优点和有益效果:1、运用底物浸泡方法测定蛋白酶谱，避免了底物在胶中对蛋白迁移率的影响，本发明所用的蛋白底物反浸的方法同底物胶的方法在耗时上基本相同，但是在活性条带的分子量的确定上却有着明显的优势，且活性条带更加清晰，如图2所示，非常有利于后续的蛋白酶鉴定工作；2、重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确，如图3所示；3、本发明所用的蛋白底物反浸的方法同电转方法相比在耗时上明显缩短，省去了电转步骤，而且不需要电转装置，且在条带清晰度及分子量准确度上基本相同；4、底物浸泡蛋白酶谱法可以用于各种蛋白酶谱的检测，有广阔的应用空间。
图1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶谱检测；图2、海洋弧菌(Vibrio )胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶谱检测；；2为酪蛋白底物胶方法；当SDS-PAGE胶中加入酪蛋白底物时，严重阻碍了胰蛋白酶的迁移率，酶解条带弥散，而本发明是将酪蛋白底物反浸入凝胶，所以不会对蛋白迁移率有任何影响，活性条带清晰；图3、胰蛋白酶活性电泳；；2为酪蛋白底物胶方法；，当SDS-PAGE胶中加入酪蛋白底物时，严重阻碍了胰蛋白酶的迁移率，造成了胰蛋白酶分子量的偏差，而本发明由于是将底物反浸入凝胶，所以不会对蛋白迁移率有任何影响，而且活性条带清晰。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所