文档介绍：6
生物工程上游技术综合设计实验
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
生命科学学院
生物工程09级1班
同组成员：
指导教师：
1
）： M；
溶液III（）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾， mL
冰醋酸， mL H2O；
饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）
氯仿
TE缓冲液（）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）: 20 µg/ml
醋酸铵（～）: mol/L
异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。
ml离心管中。
离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA， ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）
加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。
加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。
离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。
3
向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。
移取上层水相溶液（约450µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。
移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。
离心(14 000rpm，10分钟，4℃)，倒掉上清液。
ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。
真空抽干或室温自然干燥
加30~40µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用。
琼脂糖凝胶电泳（1%）：，加入50ml ，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。
每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer混匀，进行点样。
电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
以pGEM-T作对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移速度较慢。
重组质粒酶切鉴定
利用CaM5片段上的特异酶切位点HindⅢ来检验，该片段上两个位点间的DNA是219bp。
（1）酶切反应
酶切反应液的配制:
HindⅢ 1μl
10×M buffer 2μl
质粒 5μl